天津市家庭养殖环境中抗生素污染特征与风险评估

阮蓉，张克强，杜连柱，丁工尧，王素英*，支苏丽*

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；2.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；3.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

我国既是抗生素的生产大国，也是抗生素的使用大国[1]。2013年我国抗生素总产量为2.48×105t，使用量为 1.62×105t，其中 7.8×104t 为兽用[2]，兽用抗生素（Veterinary antibiotics，VAs）主要用于预防和治疗病菌引起的动物疾病及促进动物生长。养殖过程中畜禽体对抗生素的吸收是有限的，统计表明约30%～90%的抗生素以原型或代谢产物的形式随畜禽废物排出体外，并持续存在于环境中[3]。我国畜禽粪污的产生量巨大，2015 年[4]规模化养殖粪污的总产生量为3.83×1010t，给环境带来了压力。在畜禽粪污处理后作为有机资源还田的过程中，抗生素也随之进入到生态环境中，一方面改变原有环境中微生物的群落结构，另一方面通过果蔬等植物根系富集或渗入到水体系统[5-6]，进而诱导抗生素抗性基因和耐药菌的产生，最终降低抗生素的治疗率。

近年来，抗生素在环境中的污染问题引起了广泛关注。Hu 等[7]调查了我国北方地区抗生素的残留情况，发现畜禽粪便是环境中抗生素残留的主要来源之一，其中四环素类抗生素残留量高达183.50 mg·kg-1；Zhi等[8]对养殖废水中抗生素的残留研究表明，四环素类抗生素残留浓度高于其他抗生素，最高残留浓度为130.67 µg·L-1；Zhao 等[9]检测出城郊土壤中四环素类抗生素CTC 检出浓度最高为80.64 µg·kg-1，且CTC 对土壤微生物造成高风险。然而，当前大部分报道聚焦于规模化养殖粪污中抗生素残留情况，有关种养结合模式下家庭养殖环境介质中抗生素污染特征鲜有报道。家庭养殖模式虽然可以利用无害化粪污来实现畜牧业绿色发展，但也普遍存在管理不规范、粪污处理工艺和设备不完整等特点[10]。本文以天津市蓟州区为研究区域，选择20 户家庭养殖场作为采样点，采用固相萃取-高效液相色谱串联质谱法对养殖环境中常见的四大类（磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类和四环素类）37 种抗生素进行了全面研究。分析了天津市蓟州区家庭养殖环境中抗生素的总体污染特征，比较了不同来源粪便及废水中抗生素的残留差异，讨论了家庭农场周边土壤中常见抗生素的污染情况，并对土壤和废水中抗生素污染进行了风险评估，为家庭畜禽养殖过程中抗生素的残留现状及污染防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

蓟州区（39°45′～40°15′N，117°05′～117°47′E）家庭养殖场数量多、分布广，目前已建成生猪、肉牛、肉鸡、蛋鸡、特种养殖等多类养殖基地。据统计[11]，2018年蓟州区生猪存栏196.91 万头，出栏278.56 万头；牛存栏24.57 万头；家禽存栏2 230.98 万只，出栏5 435.66万只。

本研究选取蓟州区猪场10家、肉牛场5家和鸡场5 家为研究对象，养殖场内配备废水储存池和堆粪棚。粪便样品包括仔猪粪27份、肥猪粪30份、母猪粪30 份，蛋鸡粪15 份和肉牛粪15 份，堆粪棚中生猪干清粪堆放发酵粪便18份，共计135份。废水样品为各养殖场圈舍直接出水口冲洗废水和畜禽尿液的混合液体，包括猪场废水30 份和牛场废水15 份。土壤样品为各养殖场周边1 km 内施用粪肥后的农田试验土壤（猪场30 份、鸡场15 份、牛场15 份）和未施用粪肥的农田对照土壤（猪场30 份、鸡场15 份、牛场15 份）。以上每种样品含3 个平行。固体样品多点采样，混合于洁净塑封袋中，液体样品用采样器采样后混合于500 mL 采样瓶中，所有样品编号后于低温条件下运回实验室，存储于-20 ℃冰箱中。养殖场详细分布信息见图1。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

高效液相色谱串联质谱仪（HPLC-TQD，Waters公司）、冷冻干燥机（TF-FD-27，田枫实业有限公司）、固相萃取装置（Vac Elut24，Agilent 公司）、氮吹仪（NEVAPTM112，Organomation 公司）、HLB 固相萃取小柱（500 mg/6 mL，Waters 公司）、Prime HLB 固相萃取小柱（200 mg/6 mL，Waters 公司）、低温高速离心机（H2050R-1，湘仪离心机仪器有限公司）、超声波清洗器（KH-300DE，昆山禾创超声仪器有限公司）和隔膜真空泵（GM-0.33A，津腾实验设备有限公司）。

1.2.2 试剂

甲醇和乙腈（色谱纯，Merck 公司）、甲酸（色谱纯，阿拉丁）、柠檬酸和磷酸氢二钠（分析纯，阿拉丁）以及乙二胺四乙酸二钠和磷酸二氢钾（分析纯，国药有限公司）。

抗生素标准品包括四环素类（TCs）5 种：四环素（Tetracycline，TC）、强力霉素（Doxycycline，DXC）、去甲基金霉素（Demeclocycline，DMC）、土霉素（Oxytetra⁃cycline，OTC）和 盐 酸 金 霉 素（Chlorotetracycline，CTC）；大环内酯类（MLs）7 种：克拉霉素（Clarithromy⁃cin，CLA）、罗红霉素（Roxithromycin，RTM）、螺旋霉素（Spiramycin，SPI）、替米考星（Tilmicosin，TIL）、阿奇霉素（Azithromycin，AZI）、林可霉素盐酸盐单水化合物（Lincomycin，LIN）和红霉素（Erythromycin，ERY）；喹诺酮类抗生素（FQs）14 种：沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、氟甲喹（Flume⁃quine，FLU）、恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）、氟罗沙星（Fleroxacin，FLE）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM）、二氟沙星（Difloxacin，DIF）、司帕沙星（Sparfloxacin，SPA）、萘啶酸（Nalidixic acid，NAL）、达氟沙星（Dano⁃floxacin，DAN）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、西诺沙星（Cinoxacin，CIN）、奥比沙星（Orbifloxacin，ORB）和噁喹酸（Oxolinic acid，OXO）；磺胺类抗生素（SAs）11种：磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SMR）、磺胺甲二唑（Sulfamethizole，SMT）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SDMD）、磺胺邻二甲氧嘧啶（Sulfadoxin，SDX）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMX-2）、磺胺喹噁啉（Sul⁃faquinoxaline，SQX）、磺胺噁唑（Sulfamoxol，SMX-1）、磺胺异噁唑（Sulfisoxazole，SIX）、磺胺甲氧哒嗪（Sulfa⁃methoxypyridazine，SMP）、磺胺间二甲氧嘧啶（Sulfadi⁃methoxine，SDM）和 磺胺对甲氧嘧啶（Sulfameter，SME）。以上标准品纯度均大于95.0%，购于德国Dr.Ehrenstorfer。将上述抗生素标准品溶解并配制成100 µg·mL-1的各标准储备液，储存于-20 ℃冰箱中，测试前将标准储备液用甲醇逐步稀释成不同浓度的标准工作液，以制备标准曲线。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

固体样品：分别称取冷冻干燥的粪样1.000 g 和土样 5.000 g 于离心管中，加入 10 mL 提取液（V甲醇∶V乙腈∶VEDTA-McIlvaine缓冲液=1∶1∶2），超声 15 min，以 10 000 r·min-1离心15 min，收集上清液并重复提取1 次。合并两次上清液并稀释，以1 mL·min-1过活化的HLB固相萃取柱，抽真空后用6 mL 甲醇洗脱HLB 固相萃取柱，将洗脱液氮吹至近干，随后用1 mL 复溶液[0.1%甲酸水∶甲醇（1∶1，V/V）]复溶，经0.22 µm 膜过滤后上机测试。

废水样品：取50 mL废水样品，添加EDTA并调节pH 至 3.0 左右，以 10 000 r·min-1离心 15 min，收集上清液，将上清液以1 mL·min-1过活化的Prime HLB 固相萃取柱，抽真空后用6 mL 甲醇∶乙腈（1∶9，V/V）洗脱Prime HLB固相萃取柱，后续操作参照固体样品。

1.3.2 仪器检测方法

采用超高效液相色谱-质谱仪进行抗生素测试，质谱为三重四极杆串联质谱，ESI+模式，分段采集。液相的流动相A 相为0.1%甲酸、B 相为乙腈，流速为0.3 mL·min-1，进样量5 µL，采取梯度洗脱方式测试。具体洗脱条件及其他参数见参考文献[12]。

1.4 兽用抗生素风险评估

本研究采取风险商值法对养殖环境中抗生素进行风险评估。风险商（Risk quotient，RQ）是指环境中污染物实际测量浓度（MEC）与预测无效应浓度（PNEC）之间的比值。PNEC 根据急性或慢性毒理学的相关浓度（LC50或EC50）与评价因子（AF）的比值得到，土壤中抗生素相关毒理学数据较少，因此采用水中抗生素预测的无效应浓度（PNECwater）来估算土壤中预测的无效应浓度（PNECsoil）[13]。

式中：EC50为中位有效剂量，根据敏感物种毒性数据从EPA 数据库和生态毒理文献中获得；LC50为最低效应浓度；AF 评价因子根据生物毒性数据设置为1 000；Kd为水土分配系数，可据文献查询。RQ 值将生态风险划分为 3 个等级：RQ≥1 为高风险；0.1≤RQ＜1 为中风险；0.01≤RQ＜0.1为低风险[14]。

2 结果与讨论

2.1 家庭养殖环境中抗生素总体赋存特征

家庭养殖环境中各种抗生素检出率以及浓度如图2和表1所示。畜禽粪便中SAs、FQs、MLs和TCs检出率范围分别为0～21.5%、2.6%～43.59%、0～41.0%和46.2%～74.4%，TCs 检出率普遍高于其他3 类抗生素；从污染浓度看，TCs 在粪便中浓度范围最大，为ND～648.48 mg·kg-1，SAs、FQs 和 MLs 的浓度范围分别为ND～2.10、ND～1.73 mg·kg-1和ND～241.39 mg·kg-1，以上4 类抗生素在畜禽粪便中的平均浓度依次为10.02、0.01、1.36 mg·kg-1和0.98 mg·kg-1。关于粪便中抗生素残留浓度，不同学者得出了不同结论：Li 等[15]发现养殖场畜禽粪便中TCs检出浓度最高，其最大浓度（26.20 mg·kg-1）低于本研究中最大浓度（648.48 mg·kg-1）；Hu 等[7]研究环境介质中抗生素来源时，检出粪便中 TCs 浓度范围为 0.40～183.50 mg·kg-1，检出的最大浓度亦低于本研究；不同的是，Zhao 等[1]研究养殖场粪便中抗生素残留时发现，抗生素残留浓度高达1 420.76 mg·kg-1，远大于本研究的最大值。

表1 不同环境样品中抗生素浓度Table 1 Concentration of various antibiotics in different environment samples

此外，本研究发现畜禽废水中 SAs、FQs、MLs 和TCs 检出率范围分别为 0～73.3%、0～66.7%、0～26.7%和20.0%～80.0%，家庭养殖废水中MLs 检出率最低，且4大类抗生素在废水中污染浓度依次为ND～60.52、ND～13.84、ND～43.69 µg·L-1和 ND～2 029.21 µg·L-1，平均浓度分别为 0.53、0.26、0.89 µg·L-1和 70.52 µg·L-1。Zhi 等[8]研究发现规模化畜禽废水处理过程中TCs 浓度范围最高，为 0.04～130.67 µg·L-1，但低于本研究最大检出浓度，FQs和SAs检出范围分别为0.01～32.09 µg·L-1和 0.01～31.92 µg·L-1，这两类抗生素浓度与本研究相差不大。相比粪便和废水，养殖场周边农田土壤中抗生素检出种类最少，SAs、FQs、MLs 和TCs 在土壤中检出率分别为 0～2.5%、0～17.5%、0～10.0%和0～35.0%，污染浓度范围分别为ND～0.67、ND～132.27、ND～0.61 µg·kg-1和 ND～926.26 µg·kg-1，其中 TCs 平均浓度最高，为 8.13 µg·kg-1，其余 3 类抗生素平均浓度均小于 0.40 µg·kg-1。Zhao 等[9]指出土壤中TCs 浓度高达80.64 µg·kg-1，其余抗生素浓度均低于 20.00 µg·kg-1，该结果低于本研究。Li 等[15]检测出养殖场周边土壤中 TCs 浓度高达 423.00 µg·kg-1，FQs 浓度为 ND～389.00 µg·kg-1，虽然FQs 浓度范围高于本研究，但TCs浓度低于本研究。

以上3种家庭养殖环境介质中4大类抗生素都有检出，抗生素检出率为废水（0～80.0%）＞粪便（0～74.4%）＞土壤（0～35.0%），其中TCs 检出率及浓度在各养殖环境介质中均为最高，这主要是因为TCs价格低廉、副作用小、应用广[16]。家庭养殖环境中抗生素的污染问题已经非常普遍，应当引起重视。

2.2 家庭养殖粪污中抗生素的污染特征

图3 为不同畜种粪污中4 大类抗生素的污染情况。从图3a 可以看出，猪粪中4 大类抗生素均存在，∑TCs、∑MLs、∑FQs 和∑SAs 浓度范围分别为 ND～774.05、ND～241.51、ND～0.63 mg·kg-1和ND～2.17 mg·kg-1，其总浓度的平均值依次为 66.44、9.21、0.05 mg·kg-1和 0.08 mg·kg-1。Li 等[17]研究东北规模化养殖场粪便中抗生素残留时发现，猪粪中TCs 污染浓度可高达56.81 mg·kg-1，而本研究中此类抗生素最高浓度为774.05 mg·kg-1，这可能是家庭养殖过程中抗生素使用不规范造成的。如图3c 所示，鸡粪中∑TCs、∑MLs、∑FQs 和∑SAs 浓度范围分别为 0.08～16.64、ND～0.05、ND～1.96 mg·kg-1和 0.004～0.06 mg·kg-1，且抗生素总浓度的平均值依次为5.30、0.02、0.47 mg·kg-1和0.02 mg·kg-1，残留浓度明显低于猪粪。这与任君焘等[18]调查的东营地区鸡粪中抗生素的污染情况类似，TCs（0.48～1.73 mg·kg-1）浓度最高，低于本研究中浓度最大值。家庭养殖牛粪中SAs 未检出，∑TCs浓度范围为ND～1.28 mg·kg-1，其余两类浓度范围均小于0.01 mg·kg-1，∑TCs、∑MLs和∑FQs总浓度的平均值分别为0.26、3.60×10-4mg·kg-1和0.002 mg·kg-1，这与之前的报道[18]（LOD～1.49 mg·kg-1）相差较小。由于牛粪中抗生素种类和含量检出较少，因此未在图3中显示。本研究中不同畜种粪便中抗生素污染规律为：猪粪（75.78 mg·kg-1）＞鸡粪（5.80 mg·kg-1）＞牛粪（0.26 mg·kg-1），这与 Zhao 等[1]研究结果一致。不同畜种粪便中各类抗生素残留有所不同，这可能与养殖场的饲料配比、使用剂量和用药习惯有关。

家庭养殖废水是除粪便外又一种抗生素积累的重要介质。猪场废水中抗生素浓度如图3b所示，∑TCs、∑MLs、∑FQs 和∑SAs 浓度分别为 ND～2 981.61、ND～45.93、ND～14.19 µg·L-1和ND～62.70 µg·L-1，总浓度的平均值依次为 528.11、9.21、5.15 µg·L-1和 7.38µg·L-1。闾幸等[19]测定猪场废水中抗生素含量时发现，TCs 为猪场废水中主要残留种类，残留浓度为0.40～164.26µg·L-1。通过比较规模化养殖场废水中抗生素浓度[20]发现，规模化猪场废水处理设备齐全，抗生素残留浓度远低于本研究，这是因为厌氧和好氧等工艺能有效去除抗生素。在家庭牛场废水中（图3d），∑SAs、∑FQs、∑MLs 和∑TCs 浓度分别为 0.07～12.98、0.15～1.18、ND～0.54 µg·L-1和 0.88～2.97 µg·L-1，总浓度平均值分别为 2.73、0.67、0.17 µg·L-1和1.70 µg·L-1。猪场废水中抗生素总浓度平均值（549.86 µg·L-1）是牛场废水中（5.27 µg·L-1）的 104.3倍，说明猪场废水中抗生素污染更为普遍。猪场废水中TCs浓度最高，FQs含量最低，但牛场废水中SAs浓度最高，MLs含量最低，可能是因为不同畜种抗生素使用习惯不同以及抗生素在水中有不同的性质[21]。同一畜种的粪便和废水中4 大类抗生素比例存在区别，例如SAs在牛粪中未检出，而在牛场废水中则含量最高，一方面可能与养殖场的给药方式有关，另一方面与抗生素自身性质相关，肠道易吸收SAS，多经肾小球过滤排泄，因此养殖废水中有检出。考虑到鸡的养殖模式、生理结构和生活习性，本研究不涉及鸡场废水。

2.3 不同类型生猪粪便中抗生素的残留情况

由上述分析可知，生猪粪便中抗生素污染水平最高，鉴于仔猪、肥猪和母猪生长阶段和所用饲料配方不同，对不同类型生猪粪便及生猪堆肥粪便中抗生素残留情况进行了研究。整体来看，猪粪中抗生素总浓度的平均值母猪粪（23.97 mg·kg-1）＜仔猪粪（49.38 mg·kg-1）＜肥猪粪（156.59 mg·kg-1）。从图4a 至图 4c可以看出，∑TCs 在母猪粪、仔猪粪和肥猪粪中残留范围均为最高，分别为0.02～184.45、ND～194.86 mg·kg-1和 0.18～774.05 mg·kg-1；肥猪粪中∑TCs 平均值（132.39 mg·kg-1）分别为仔猪粪（46.63 mg·kg-1）和母猪粪平均值（23.57 mg·kg-1）的 2.8 倍和 5.6 倍。仔猪粪和肥猪粪中MLs含量仅次于TCs，∑MLs在仔猪粪、肥猪粪和母猪粪中浓度范围分别为ND～16.86、ND～241.51 mg·kg-1和 ND～1.02 mg·kg-1，∑MLs 均值表现为肥猪粪（24.19 mg·kg-1）＞仔猪粪（2.65 mg·kg-1）＞母猪粪（0.13 mg·kg-1）。MLs和TCs在肥猪粪便中污染更为普遍。

猪粪中FQs 与SAs 检出率小于11%，∑FQs 检出浓度＜1.00 mg·kg-1，仔猪粪中∑FQs 平均浓度（0.10 mg·kg-1）大于母猪粪（0.05 mg·kg-1）和肥猪粪（0.008 mg·kg-1），说明仔猪FQs 的使用量大于肥猪和母猪。母猪粪∑SAs 检出平均浓度（0.22 mg·kg-1）远大于肥猪粪∑SAs（0.004 mg·kg-1）和仔猪粪∑SAs（0.001 mg·kg-1），这与Pan 等[22]的研究结果有所不同。整体来看，4类抗生素在3种类型生猪粪便中整体趋势相似，TCs 是主要的抗生素污染类型。此外，母猪粪中总浓度平均值最低，肥猪粪中总浓度平均值最高，这可能是因为母猪妊娠期对抗生素的用量尤其谨慎，而肥猪中抗生素主要起到促生长作用，因此用量更大[1]。

家庭农场堆肥粪便中抗生素污染情况如图4d所示，在堆肥粪便中∑TCs（ND～341.94 mg·kg-1）＞∑MLs（ND～76.64 mg·kg-1）＞∑FQs（ND～0.19 mg·kg-1）＞∑SAs（ND～0.02 mg·kg-1），均值分别为66.71、12.78、0.03 mg·kg-1和0.004 mg·kg-1，这与鲜猪粪中4 大类抗生素的浓度顺序相似。堆肥后抗生素浓度有所降低，这一方面是由于微生物的吸收转化作用，另一方面是抗生素自身性质与高温等环境因素[23]作用的结果。

2.4 家庭养殖粪肥施用对周边土壤的影响

为明确家庭养殖畜禽粪肥的施用对农田土壤的影响，本研究对养殖场周边农田土壤中抗生素污染情况做了全面的研究。不同养殖场施粪土和未施粪土中抗生素污染情况如图5 所示。从污染水平看，鸡场施粪土中抗生素总浓度（1 291.06 µg·kg-1）为未施粪土中抗生素总浓度（102.51 µg·kg-1）的 12.6 倍，猪场施粪土中抗生素总浓度（423.48µg·kg-1）为未施粪土中抗生素总浓度（12.04 µg·kg-1）的35.9 倍，牛场施粪土中抗生素总浓度（22.48 µg·kg-1）为未施粪土中抗生素总浓度（2.31 µg·kg-1）的 9.7 倍。从施用粪肥后土壤中抗生素增加倍数来看，猪场土壤中抗生素污染倍数最大，其次是鸡场土壤，这与不同畜种粪便中抗生素浓度大小一致，说明粪肥施用是农田土壤中抗生素的主要来源。此外，调查还发现农场周边土壤中TCs 浓度最大，其次是FQs，其余两类抗生素检出较少，这可能与养殖场抗生素使用量有关，也可能是抗生素在土壤中降解机制不同造成的[24]。

2.5 养殖环境生态风险评估

农村地区家庭养殖过程中，养殖废水和施肥土壤中依旧残留大量抗生素，因此评估抗生素在养殖环境（土壤和废水）中的生态风险意义重大。根据上述结果，针对废水和土壤中检出浓度较大和检出率较高的5 种抗生素（OTC、TC、CTC、DXC 和CIP）进行生态风险评估，其毒理学数据如表2所示。

各种抗生素在环境中的RQ 值如图6 和图7 所示，废水中抗生素的生态风险高于土壤中抗生素生态风险。从图 6 可知，废水中 OTC、TC 和CTC 均呈现出高风险，其中OTC 高风险出现的频率最高。猪场废水中这3 种抗生素高风险频率显著多于牛场废水；DXC 在猪场废水中呈现中、高风险，而在牛场废水中呈低风险状态；对于CIP，在牛场废水中无检出，而在猪场废水中为低风险。土壤中5种抗生素RQ 值如图7 所示，从图中可以看出，土壤中抗生素低风险居多。试验土壤中抗生素风险明显高于未施粪空白土壤；猪场施粪土中抗生素呈现中、高风险，鸡场施粪土中抗生素呈现中、低风险，而牛场施粪土中抗生素均为低风险，这与施肥土壤中抗生素的污染倍数有直接关系。对于不同种类抗生素，CIP和TC在施粪土中呈低风险，而在未施粪土中未检出，OTC 和CTC 在个别养殖场出现了中风险，值得注意的是OTC 是土壤中唯一呈现高风险的抗生素。这显示农村家庭养殖过程中抗生素污染已经成为一个非常严重的问题，只有从源头控制才能降低抗生素对环境的风险。

表2 抗生素生态风险参数Table 2 Antibiotic ecological risk parameters

3 结论

（1）天津市家庭养殖粪污中抗生素残留普遍存在，其中四环素类抗生素检出率和浓度在不同环境介质中均为最高。

（2）家庭养殖环境介质中抗生素污染水平各不相同，畜禽粪便中猪粪＞鸡粪＞牛粪；家庭养殖场废水中抗生素浓度规律为猪场＞牛场；养殖场周边土壤中抗生素浓度倍数规律为猪场＞鸡场＞牛场。

（3）抗生素的残留对家庭养殖环境产生了生态风险，猪场废水中典型抗生素的生态风险高于牛场废水；粪肥的施用增加了土壤中抗生素的生态风险，其中猪场土壤中抗生素污染风险程度高于鸡场土壤和牛场土壤。家庭养殖场环境介质中抗生素的污染问题应当引起足够重视。