猪源大肠杆菌耐药性及相关耐药基因检测

孙慧琴，轩慧勇，买占海，杨紫嫣，夏利宁

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种典型的革兰氏阴性无芽孢直杆菌，是人和动物肠道菌群的重要组成部分，在卫生学上被作为卫生监督的指示菌[1]。【前人研究进展】大肠杆菌作为条件性致病菌，在一定条件下可引起人体或动物胃肠道感染、尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等疾病，在细菌引发的疾病中居世界首位[2]。抗菌药物的压力选择下使细菌产生耐药性和抗生素抗性基因[3]。【本研究切入点】大肠杆菌作为人和动物的肠道共栖菌以及耐药基因贮存库，可以通过质粒和耐药基因传递等多种方式将耐药性传播给人类[4]。目前有关新疆阿克苏地区猪源大肠杆菌的耐药情况鲜见报道。研究猪源大肠杆菌耐药性及相关耐药基因检测。【拟解决的关键问题】研究新疆阿克苏地区某规模化养猪场猪源大肠杆菌耐药性以及对耐药菌株进行相关耐药基因检测。分析该地区猪源大肠杆菌耐药现状及耐药基因携带情况，为该地区大肠杆菌流行病学研究和临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品来源

2018年11月9～12日，在新疆阿克苏地区某规模化猪场进行猪源肛拭子的采集。通过灭菌棉签采集猪直肠粪样于装有1 mL MH肉汤的2 mL EP管中，共采集1 203份样品，分离试验用大肠杆菌。

1.1.2 菌株及培养基

大肠杆菌标准质控菌(ATCC 25922)购自杭州天和微生物试剂有限公司；麦康凯培养基、普通肉汤和Mueller-Hinton(MH)培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.3 药 品

酰胺醇类：氟苯尼考(FFC/含量98.0%)；喹诺酮类：环丙沙星(CIP/含量93.9%)、诺氟沙星(NOR/含量99.9%)和恩诺沙星(ENR/含量100%)；氨基糖苷类：链霉素硫酸盐(STR/含量95.0%)、庆大霉素硫酸盐(GM/含量59.0%)、阿米卡星(AMK/含量99.1%)、安普霉素(APR/含量599 μ/mg)、盐酸大观霉素(SPT/含量97.0%)；四环素类：盐酸土霉素(OTC/含量89.5%)、盐酸金霉素(AM/含量90.0%)；β-内酰胺类：头孢噻呋(CEF/含量89.6%)；多肽类：多黏菌素E(CL/含量100%)。

1.2 方 法

1.2.1 大肠杆菌的分离鉴定

用灭菌棉签轻轻旋转插入猪的肛门内，将沾有粪样的棉签放入含有1 mL灭菌MH肉汤的2 mL EP管中。置于37℃恒温培养箱内增菌培养3～6 h，用接种环蘸取少量增菌液在麦康凯琼脂平板上划线，倒置于37℃恒温培养箱内培养24 h后，挑取平板上粉红色的单菌落，为疑似大肠杆菌，对分离到的疑似大肠杆菌进行大肠杆菌管家基因uidA的鉴定[5]，uidA基因PCR扩增反应体系(20 μL)：2 ×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板0.5 μL，dd H2O 8.5 μL，用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测后将目的片段进行胶回收并送上海生物工程技术服务有限公司测序。确定为大肠杆菌的菌株，用灭菌的60%甘油保菌，于-20℃保存备用。

1.2.2 药物敏感性

按欧盟药敏试验标准委员会(EUCAST)推荐的琼脂稀释法[6]，对分离得到的大肠杆菌进行临床常用13种抗菌药物最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值测定。以ATCC 25922菌株作为标准质控菌，结果判定参照EUCAST标准，以敏感、中介和耐药3种形式记录结果。表1

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.3 DNA模板制备与耐药基因的检测

将纯化的大肠杆菌复苏后划线接种在麦康凯固体培养基上，倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。挑取1个单菌落至装有50 μL Tris-EDTA 缓冲液的灭菌八联管中。95℃煮沸15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，-20℃保存备用。

根据相关参考文献[7～10]合成4大类10种耐药基因(酰胺醇类floR；喹诺酮类qnrS、qnrD、oqxA、oqxB；氨基糖苷类ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib、rmtB；四环素类tetM、tetK)，引物序列具体信息见表2。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统拍照分析，将目的片段进行胶回收并送上海生物工程技术服务有限公司测序，获取的序列利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序进行比对分析，最后确定基因型。表2

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌的分离鉴定

共采集阿克苏地区某规模化养猪场1 203份样品，经过麦康凯培养基2次纯化及大肠杆菌管家基因uidA鉴定后，最终分离出大肠杆菌443株，总体分离率为36.8%。

2.2 大肠杆菌药敏

研究表明，大肠杆菌对土霉素的耐药率最高(100%)；对金霉素(99.0%)、链霉素(99.0%)、大观霉素(95.0%)、恩诺沙星(92.0%)的耐药率均高于90.0%；对庆大霉素(81.0%)、氟苯尼考(75.0%)、环丙沙星(73.0%)的耐药率均高于70.0%；对诺氟沙星(48.0%)耐药率未超过50.0%；对阿米卡星(4.9%)、安普霉素(16.6%)、头孢噻呋(23.5%)和多黏菌素E(15.8%)具有较好的敏感性，耐药率未超过25.0%。图1

表2 耐药基因引物序列Table 2 The resistant genes primer sequences

2.3 大肠杆菌多药耐药结果

研究表明，该猪场大肠杆菌对被检13种抗菌药物的多药耐药在0耐(0.2%)和3～13耐有分布，以7～9耐为主，占63.6%，且以9耐最高，为26.1%。图2

2.4 大肠杆菌耐药基因检出结果

研究表明，对floR(66.4%)和ant(3″)-Ia(66.4%)检出率最高；对qnrS(31.4%)和tetM(31.4%)检出率次之；对aac(6′)-Ib(17.8%)、oqxA(17.6%)、oqxB(17.4%)、rmtB(4.3%)、qnrD(1.4%)耐药基因均有检出，未检出tetK基因。

3 讨 论

3.1 大肠杆菌耐药

大肠杆菌的分离率仅为36.8%，分离率远低于南海辰(83.6%)[9]和程伟华(99.9%)[11]所报道的菌株分离率，与张瑜(54.0%)[12]报道的猪源大肠杆菌的分离率较为相近，高于王桂琴[13]报道的奶牛乳房炎大肠杆菌分离率(7.51%～15.84%)。分析大肠杆菌分离率较低的原因是，11月新疆阿克苏地区气温较低，低温季节不利于菌株的生长和繁殖[14]，可能会导致所采样品中活菌数量较少；此外，从阿克苏到乌鲁木齐有长达1 015.3 km的路途，样品运输时间较长，未能及时增菌致使部分样菌失活，可能也是导致分离率较低的原因之一。

药敏试验结果表明，该养殖场猪源大肠杆菌对被检抗菌药物呈现高耐药和高敏感现象。对酰胺醇类、喹诺酮类和四环素类抗菌药物的耐药情况严重，耐药率均高达90%以上，耐药率由高到低依次为土霉素>金霉素=链霉素>大观霉素>恩诺沙星>氟苯尼考>环丙沙星，耐药结果高于轩慧勇[15]的报道，但与李崇[16]报道的广西某地区的耐药结果一致。长期反复的使用喹诺酮类和酰胺醇类抗菌药物，尽管采用联合用药方式，但随着该类抗菌药物的广泛使用，导致该养殖场大肠杆菌对氟喹诺酮类和酰胺醇类的耐药情况严重，且存在交叉耐药[17]；由于加大剂量用药甚至是不按疗程用药，不仅导致药物残留，也使菌株产生耐药。

尽管该养殖场耐药情况严重，但对被检的氨基糖苷类、β-内酰胺类和多肽类的抗菌药物具有较好的敏感性，与傅力等[18]报道的耐药结果一致。

由于该养殖场呈现高耐药和高敏感结果，所以该养殖场的多药耐药集中在7～9耐，并以9耐谱型FFC+CIP+NOR+ENR+STR+GM+SPT+AM+OTC为主，该养殖场可结合药敏试验结果，在目前的用药模式上调整或合理选用具有较高敏感性的抗菌药物，结合其他未使用过的抗菌药物进行联合用药并规范用药，在提高治疗效果的同时，也降低该养殖场猪源耐药大肠杆菌的出现。

3.2 大肠杆菌耐药基因检测

耐药基因与耐药表型基本一致，研究耐药基因检测结果显示，对喹诺酮类耐药率在70.0%～90.0%，对喹诺酮类耐药基因检出率为67.8%(31.4%携带qnrS基因、17.6%携带oqxA基因、17.4%携带oqxB基因、1.4%携带qnrD基因)；对酰胺醇类耐药率为75.0%，对酰胺醇类floR基因检出率为66.4%；对部分氨基糖苷类耐药率高达90.0%以上，对氨基糖苷类耐药基因检出率高达88.5%(66.4%携带ant(3″)-Ia基因、17.8%携带aac(6′)-Ib基因、4.3%携带rmtB基因)，以上结果表明，细菌携带的耐药基因在细菌产生耐药中具有重要的作用。同时，试验结果显示，该养殖场对酰胺醇类和氨基糖苷类抗菌药物的耐药主要是由于携带floR(66.4%)和ant(3″)-Ia(66.4%)耐药基因所致，对喹诺酮类抗菌药物的耐药主要是由于携带qnrS(31.4%)耐药基因；对四环素类的耐药主要是tetM(31.4%)耐药基因所致，但对四环素类耐药率高达95.0%以上，但四环素类耐药基因检出率仅为31.4%，众所周知，细菌产生耐药性的机制十分复杂，存在多个同类耐药基因共同介导一种药物耐药的现象，比如对四环素类抗菌药物产生耐药，不仅是tetM、tetK这2个基因决定，还有其他基因(如tetA、tetB等)[19]和质粒介导的耐药，甚至是新的耐药基因(如tetX3、tetX4)[20]、耐药决定区基因的变异和新的耐药机制同样介导细菌耐药的产生。研究所选取的10种耐药基因仅是4大类抗菌药物中的主要耐药基因，细菌对上述被检抗菌药物耐药的产生可能是由于这些耐药基因所介导，阿克苏地区猪源大肠杆菌很可能还存在其他非耐药基因介导或未知耐药基因介导的耐药机制。

4 结 论

新疆阿克苏地区某规模化猪场猪源大肠杆菌对被检的13种抗菌药物耐药结果呈现高耐药和高敏感，对临床常用抗菌药物如氟苯尼考、环丙沙星等耐药率高达90%以上；对阿米卡星、多黏菌素E等具有较好的敏感性；多药耐药集中在6～9耐，主要以携带floR和ant(3″)-Ia基因为主。因此，该猪场在治疗大肠杆菌病时应结合药敏试验结果，合理轮换使用抗菌药物，同时加强环境消毒意识，减少菌株间耐药性的传播。