忍冬鉴别研究进展

李萌萌 ，王 倩 ，孟 露 ，李佳欣 ，张雅秀 ，张 勇 ，常 明

（1.河北科技大学 化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018；2.石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035）

0 引言

忍冬始载于《名医别录》，《新修本草》和《证类本草》等古籍均有收录[1]. 忍冬是我国常用的中草药，其药用价值高、用途广泛，是清热解毒主流的大宗药材[2]. 忍冬在中国大部分地区多有分布，不少地区已栽培生产，其中以河南、山东所产最为闻名. 我国忍冬属植物共98 种，有药用价值的仅有14 种. 由于忍冬属植株外形相似，对其中药用忍冬的鉴别仅靠形态进行甄别难以操作和实施. 对无药用功能的忍冬进行准确的鉴别，避免临床误用是一个挑战. 近年来，仪器分析方法对忍冬进行鉴别的报道屡见不鲜.

近代研究表明其花（金银花）、藤（忍冬藤）、忍冬叶均具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化、免疫调节、保肝利胆、抗肿瘤、降糖降脂等药理作用. 在2005 版《中国药典》之前，金银花和山银花作为同一种药材收载，从2005 版《中国药典》开始，正式将金银花和山银花进行区分，两者并非同种药材. 金银花因其含有的活性成分对病毒活性、炎症因子有抑制作用以及对机体淋巴细胞增殖有促进作用，被广泛应用在临床抗病毒方面. 其中一些抗流感病毒的中成药中也含有金银花，如连花清瘟胶囊、金银花口服液、双黄连口服液等. 而且由于近几年临床对金银花需求量剧增，忍冬属其他产品鱼龙混杂，干扰了临床使用，因此对忍冬属植物进行鉴别研究困扰着中药行业工作者及广大消费者. 本研究对金银花、忍冬叶及藤常用鉴别方法进行归纳总结，以期为我国忍冬产业的健康发展提供有意义的科学借鉴.

1 忍冬的鉴别

1.1 金银花的鉴别

1.1.1 薄层色谱法对金银花的鉴别研究

陈永林等[3]采用薄层色谱（TLC）法开展了对金银花及两种混伪品（金银木的花和瑞香科芫花的花）的鉴别研究工作. 其中TLC 法展开剂的条件是VCH3COOC2H5∶VCH3COOH=4∶1. 结果显示，金银木花与忍冬花有两处斑点的颜色和比移值（Rf）不同，在Rf值0.13 处增加了一个淡蓝色斑点，在0.88 处有一个红色斑点，易于区分两者. 芫花与忍冬花差异显著，更容易鉴别.

王立伟等[4]采用TLC 法对金银花中掺伪山银花进行快速鉴别，通过试验建立了金银花和山银花的TLC色谱方法，得出山银花和金银花的薄层色谱斑点有差异性，该方法可用于快速鉴别金银花与山银花.

丁野等[5]采用TLC 法对忍冬和灰毡毛忍冬进行了鉴别. 其中，TLC 法的展开剂条件为：VCCl3H∶VCH3OH∶VH2O=6∶4∶1，将灰毡毛忍冬皂苷乙作为对照品，结果显示，忍冬供试品与对照品相比，两者在相同位置上未显示相同斑点，但灰毡毛忍冬供试品与对照品相比，相同位置上则显示出相同颜色的斑点. 由此看来，该方法可用于忍冬和灰毡毛忍冬的鉴别.

采用TLC 法鉴别金银花具有简便、检测速度快、成本低的优点，是目前金银花鉴别的常见方法，但此方法主要依靠人工视觉观察TLC 的斑点及相关Rf值，因此结果误差较大，通常只适合于金银花的一般鉴别.

1.1.2 高效液相色谱法对于金银花的鉴别研究

王浩兵等[6]建立了超高效液相色谱（UHPLC）法对金银花和山银花定性及定量测定方法. 以木犀草苷，异绿原酸A、B、C，新绿原酸，隐绿原酸，灰毡毛忍冬皂苷乙作为对照品，以不同产地的金银花和山银花为供试品进行测定. 结果显示，该方法中各成分线性良好，回收率为98.71%～100.85%，相对标准偏差（RSD）为0.53%～1.87%. 灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙只能在山银花中被检出，而在金银花中未检出. 故通过此方法可将金银花和山银花区分开来.

向增旭等[7]采用高效液相色谱（HPLC）法开展了道地金银花和非道地金银花的鉴别研究工作. 其中以金银花为对照品，以道地和非道地金银花药材为供试品进行测定. 结果显示，产区为山东和河南的道地金银花共有18 个峰，药材的相似度均在0.95 以上，而非道地金银花共有9 个峰，且药材的相似度均小于0.90. 因此通过此方法可以区分道地和非道地的金银花.

UHPLC/HPLC 法可以同时对多组分进行定性、定量分析，具有快速、灵敏、准确的特点，UHPLC/HPLC 法不仅在定量，而且在定性方面优于TLC 法，同时为金银花精确的质量控制提供了科学方法.

1.1.3 中红外光谱法对金银花的鉴别研究

张芳等[8]采用三级中红外（MIR）光谱法对不同种质忍冬花蕾进行分析鉴定. 其中不同种质忍冬包括：大鸡爪、红鸡爪、红梗子、小毛花、大毛花和九丰1 号. 实验发现：一维MIR 光谱上不同种质间相似度较大，其红外吸收模式包括：νOH-忍冬花蕾、νas-CH2-忍冬花蕾、νs-CH2-忍冬花蕾、νC=O-忍冬花蕾、νC=C-忍冬花蕾和 νC-O-忍冬花蕾；不同种质忍冬花蕾的二阶导数MIR 及二维MIR 光谱差异明显.

杨春艳等[9]基于MIR 光谱技术对金银花的品种和产地进行鉴别研究，采集并测试了5 个产地的9 个品种（北花一号/山西黎城、大毛花/河南封丘、大毛花/山东平邑、鸡爪花/河南封丘、鸡爪花/河南原阳、九丰1 号/河南封丘、九丰1 号/山东平邑、四季花/山东平邑、四季花/河南封丘、小草花/山东广饶、小毛花/河南原阳、豫封1 号/河南封丘、豫封1 号/河南原阳、淮蜜花/山东平邑和淮蜜花/河南原阳）的150 份金银花样本的MIR 光谱，并计算了样品的一阶导数MIR 光谱和二阶导数MIR 光谱. 研究发现：二阶导数MIR 光谱数据为判别变量建立的模型鉴别效果相对较好，对金银花的品种和产地的鉴别正确率依次达93.20%和96.13%.

MIR 光谱法鉴别金银花具有快速、准确的优点，是金银花鉴别的常见方法.

1.1.4 近红外光谱法对金银花的鉴别研究

陈璐等[10]采用近红外（NIR）光谱法开展了不同产地（河北省、河南省、重庆市和山东省）金银花的鉴别研究工作. 利用偏最小二乘判别分析法建立判别模型. 采用二阶导数和标准正态变量预处理光谱，金银花产地判别模型正确判别率可达100%.

刘征辉等[11]采用NIR 光谱法，在主成分分析的聚类基础上通过相似分类法（SIMCA）模式识别原理对金银花（大毛花和四季花）和山银花（黄褐毛忍冬、红腺忍冬、灰毡毛忍冬和华南忍冬）分别建立了类模型，并能够正确识别. 其中，大毛花的产地包括：山东省平邑县、山东省费县、云南省寻甸县、河北省满城县、河北省巨鹿县、广西省资源县、广东省韶关市、河南省封丘县、浙江省永嘉县；四季花的产地包括：山东省平邑县；黄褐毛忍冬的产地包括：贵州省兴义市；红腺忍冬的产地包括：浙江省永嘉县、福建省南平市、广西省忻城县、广西省马山县；灰毡毛忍冬的产地包括：重庆市秀山县、湖南省溆浦县、湖南省隆回县；华南忍冬的产地包括：广东省韶关市.

NIR 光谱法需要建立庞大的数据库及复杂的数学模型，无疑会影响其在金银花鉴别领域的广泛应用.

1.1.5 紫外光谱法对金银花的鉴别研究

刘来正等[12]采用紫外（UV）光谱法，分别对无水乙醇、水、氯仿和石油醚4 种溶剂的山银花（灰毡毛忍冬/湖南隆回金银花科技开发公司出品）与华西忍冬（产地：山西）的浸出液进行紫外扫描，并测定其吸收峰的数目及对应的频率. 研究发现：山银花与其伪品华西忍冬的UV 光谱线组图像中最大吸收峰对应的吸收频率和其他吸收峰峰位值在水和石油醚中对应的吸收频率具有较大差异，而山银花与其伪品华西忍冬在无水乙醇和氯仿中虽然最大吸收峰频率相同，但其他峰对应的吸收频率有一些差异性.

刘涛等[13]采用紫外可见分光光度计法分别测定10 批金银花药材（产地分别为四川省、山东省）与10批山银花药材（产地分别为四川省、云南省、贵州省、江西省），建立了金银花药材的对照紫外-可见指纹图谱，利用相关系数法计算10 批山银花样品与金银花对照品指纹图谱的相似度，研究发现：山银花药材图谱与金银花对照品指纹图谱的相似度均在0.957 以上，表明金银花药材和山银花药材的内在质量有较高的相似性.

徐艳红等[14]采用UV 光谱法对用50%甲醇处理过的金银花和金银忍冬进行紫外扫描，在波长为200～400 nm范围内测定其吸收光谱.结果表明：金银花和金银忍冬在波长为327 nm 左右都有吸收峰出现，该峰为绿原酸吸收峰，而金银花在234.5 nm 和217.5 nm 处仍有吸收峰，两者的吸收峰有不同之处，由此可以用此方法来鉴别金银花和金银忍冬.

UV 光谱法鉴别金银花的相关方法的研究较少，其应用广泛性还需进一步研究.

1.1.6 毛细管电泳指纹图谱法对金银花的鉴别研究

孙国祥等[15]采用毛细管电泳指纹图谱（CEFP）法将13 个不同产地的金银花药材（1 号河北省巨鹿县、2号山东省临沂市、3 号河南省新乡市、4 号山东省平邑县流峪镇、5 号山东省费县、6 号河南省商洛市、7 号陕西省宝鸡市、8 号陕西省柞水县、9 号贵州省黔西南州、10 号河南省封丘县、11 号湖南省隆回县、12 号新疆省新和县、13 号市售）供试液的CEFP 进行比较. 研究发现金银花的共有指纹峰为18 个.

CEFP 法是一类较为新型的中药检测鉴别方法，其具有成本低廉、分离效能高、较好重现性及精密度高的优点.

1.1.7 DNA 分子标记法对金银花的鉴别研究

宋雯舒等[16]通过指标成分含量测定及DNA 分子标记技术对不同产地（河北省安国一方中药材有限公司出品和山东省广东广弘药材有限公司出品）金银花样品进行鉴别研究. 分别提取对照药材及河北省和山东省产地金银花样品DNA，检测DNA 浓度和纯度，采用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的DNA 分子标记技术鉴别样品.

DNA 分子鉴定技术作为常规鉴别方法的补充，具有准确、重现性高等优点，可用于金银花的鉴定，但对测试仪器及实验条件有较高的要求.

1.2 忍冬叶的鉴别

1.2.1 HPLC 法对忍冬叶的鉴别研究

童凯等[17]以4 类忍冬叶片（四季金银花叶/四川省雅安市天全县、灰毡毛忍冬叶/四川省雅安市天全县、红腺忍冬叶/四川省雅安市天全县、“北花1 号”金银花叶/四川省雅安市天全县）为实验材料，采用HPLC 法构建金银花叶的化学成分的指纹图谱，从中提取了特征色谱峰，结合主成分分析、系统聚类分析等多变量统计分析方法，比较分析了4 种不同品种的金银花叶的化学物质群差异. 研究发现：相较于四季金银花，“北花1号”品种与之具有最相似化学特征，依次为红腺忍冬和灰毡毛忍冬.

管雪梅[18]以10 个不同产地忍冬叶为实验材料，通过对色谱条件的筛选，最终确定以0.3%甲酸水溶液和乙腈为流动相，采用梯度洗脱方式的实验条件. 研究发现：10 种忍冬叶的14 个共有峰的相对保留时间基本一致，指纹图谱的相似度在0.9 以上，但是各色谱峰峰面积在不同样品间有一定差异，不同样品忍冬叶50%甲醇提取物中的化学成分含量具有明显差异，该研究为忍冬叶的鉴定提供了参考依据，并建立了全方位的忍冬叶药材的指纹图谱.

1.2.2 TCL 法对于忍冬叶的鉴别研究

龙立慧等[19]采用 TLC 法对黔产忍冬叶进行鉴别. 绿原酸以 VCH3COOC2H5∶VCH3COCH3∶VHCOOH∶VH2O=7∶3∶1∶1.2 为展开系统，木犀草苷以 VCH3COOC4H9∶VHCOOH∶VH2O=7∶2.5∶2.5 上层溶液为展开系统. 忍冬叶产地包括：P1 龙里县、P2 安顺市、P3 兴义市、P4 贵阳市、P5 怀化市、P6 凯里市、P7 遵义市、P8 息峰县、P9 毕节市、P10 铜仁市、P11 六盘水市、P12 都匀县、P13 贞丰县、P14 修文县和 P15 织金县.

1.2.3 电镜法对忍冬叶的鉴别研究

黄丽华等[20]采用扫描电镜对忍冬属8 种不同产地的药用植物叶（细毡毛忍冬叶/贵州省印江县、净花菰腺忍冬叶/贵州省独山县、忍冬叶/贵州省凯里市、金银忍冬叶/贵州省遵义市、黄褐毛忍冬叶/贵州省兴义市、红腺忍冬叶/贵州省凯里市、短柄忍冬叶/贵州省绥阳县以及异毛忍冬叶/贵州省嘉波县）表面进行观察. 研究发现忍冬属8 种植物叶表面特征均有一定的差异.

1.2.4 显微法对忍冬叶的鉴别研究

刘湘丹等[21]采用性状鉴别和显微鉴别的方法从叶片外部形态和内部构造进行对比研究. 研究发现：灰毡毛忍冬及其变异株（湖南中医药大学药用植物园）与忍冬叶（湖南中医药大学药用植物园）在内部构造（气孔指数、毛茸等）和外部形态（叶大小、叶形）均有较大的差异.

耿世磊等[22]利用光学显微镜和扫描电子显微镜观察比较忍冬属5 种植物（华南忍冬叶/华南农业大学药用植物研究中心、忍冬叶/华南农业大学药用植物研究中心、红腺忍冬叶/华南农业大学药用植物研究中心、水忍冬叶/华南农业大学药用植物研究中心、大花忍冬叶/华南农业大学药用植物研究中心）的叶表皮特征.研究发现：在光学显微镜和扫描电镜下该属不同植物的叶表皮特征存在显著差异.

郭庆梅等[23]通过采用直尺测量叶片的长度和宽度，在生物显微镜下计数不同农家品种忍冬叶表面非腺毛的密度，测量其长度、壁的厚度等. 该研究观察忍冬11 个农家品种叶，包括：小毛花叶/黏土种植、大毛花叶/砂土种植、小鸡爪叶/砂土种植、细毛针叶/砂土种植、红裤腿叶/砂土种植、大麻叶/砂土种植、麻针叶/砂土种植、大鸡爪叶/砂壤土种植、大毛花叶/砂壤土种植、大麻叶/ 牻砂土种植、 牛儿腿叶/砂土种植. 研究发现：不同农家品种间的忍冬叶片的长度、非腺毛的密度、宽度以及长宽比、长度、壁的厚度等均存在着一定的差异性.

1.3 忍冬藤的鉴别

1.3.1 基源-性状-显微鉴别法

王兵等[24]采用基源-性状-显微鉴别法对忍冬藤（山西省中医学院提供）与其伪品连翘茎（产地：山西省太原市）和金银忍冬藤（产地：山西省太原市）进行比较和鉴别. 实验发现：忍冬藤、连翘茎及金银忍冬藤在基源、性状及显微特征方面均存在一定差异.

1.3.2 性状-显微-薄层鉴别法

陈婷等[25]采用性状-显微-薄层鉴别法开展了忍冬藤（产地：湖南省及山东省）与灰毡毛忍冬藤（产地：湖南省）的鉴别研究. 该研究采用性状鉴别方法观察忍冬藤与灰毡毛忍冬藤的外观性状的差别，采用组织切片显微鉴别法鉴别忍冬藤与灰毡毛忍冬藤的组织横切面的不同之处；采用TLC 法对忍冬藤与灰毡毛忍冬藤进行定性鉴别.

1.3.3 显微-HPLC 法-MIR 光谱-DNA 法

苏征[26]采用复杂的显微-HPLC 法-MIR 光谱-DNA 法对忍冬的新品种（华金6 号/山东中医药大学药用植物园、华金3 号/山东中医药大学药用植物园和华金2 号/山东中医药大学药用植物园）和农家品种（鸡爪花/山东中医药大学药用植物园）的藤茎进行生药学比较研究. 利用生药学技术手段观察比较原植株形态、药材性状及显微特征，利用HPLC 法测定药材活性成分含量，采用主成分分析（PCA）法进行了比较，并初步制定了新品种忍冬藤的指纹图谱. 利用MIR 光谱法制定了4 种药材的二级结构MIR 光谱谱图. 应用分子生物学方法对不同品种的忍冬进行DNA 条形码的研究，对新品种忍冬进行快速准确鉴别. 生药学性状研究中发现不同品种忍冬藤在形态外观性状上存在一定差异，显微鉴别发现各品种差异不大；利用HPLC 法结合PCA法对不同品种忍冬藤质量进行主成分分析，华金6 号质量综合最佳；HPLC 指纹图谱对新品种忍冬藤鉴别提供了可能，MIR 光谱法对官能团进行比较，未发现明显差异；生物分子学手段得出华金6 号变异最大，华金3号和华金2 号聚为一类.

2 结语

中药材的鉴别研究是一个精密的分析过程. 从简单活性成分的鉴别到针对中药材产地的地域鉴别，甚至对地域进行条形码溯源都离不开精准的鉴别技术. 本研究对近年来忍冬的花蕾、叶及藤的常见鉴别方法进行了综述. 其中忍冬花蕾（金银花）的鉴别报道较多，忍冬藤的鉴别报道较少. 鉴别方法主要包括：TLC 法、HPLC 法、MIR 光谱法、NIR 光谱法、UV 光谱法、CEFP 法、DNA 分子标记法、显微法，其中 TLC 法因其操作简便、设备简单、重分离速度快等优点被用作中药鉴别最常用的方法之一. 但随着HPLC 技术的发展，TLC 法应用的局限性逐渐凸显出来，如结果重复性差、展开剂具有一定毒性、稳定性较差等. HPLC 法在定量定性方面均优于TLC 法，并且HPLC 法可以联用不同检测器弥补本身的不足之处，实现了对各类成分的定量和定性检测，将成为中药质量控制的主要技术方法之一.