基于线粒体COI基因5′端区段粉螨DNA条形码研究

张兰香，詹雨娟，李梦珠，王 严，李心玫，褚凌渺，孙恩涛

(皖南医学院 卫生检验与检疫学教研室，安徽 芜湖 241002)

粉螨隶属于蜱螨亚纲(Acari)、真螨总目(Acariformes)、无气门亚目(Astigmata)。粉螨种类繁多,是重要的致敏原,可导致螨性过敏性疾病[1]。不同粉螨所含致敏原不同,因此,粉螨的准确鉴定可为临床药物和免疫治疗提供基础资料[2]。螨类鉴定主要依据成螨形态,然而粉螨个体微小、生境复杂等现象难以实现快速准确的形态学鉴定[3]。

自2003年Hebert等[4]提出DNA条形码概念,DNA条形码广泛应用于物种鉴定[5-6]。目前,常用于螨类鉴定的分子标记主要包括线粒体基因和核基因[5-7]。线粒体COI基因具有较快的进化速率、明显的种间差异、较低的种内变异等特性,因而常用于探讨近缘种、地理种群等低级阶元的鉴定[7-9]。Webster等[8]基于377 bpCOI基因中央区段鉴定粗脚粉螨(Acarussiro)及其近缘种小粗脚粉螨(A.farris)和静粉螨(A.immobilis)；吴太葆[9]基于该中央区段研究不同地理种群的椭圆食粉螨(Aleuroglyphusovatus)和腐食酪螨(T.putrescentiae),未发现不同地理种群间该中央区段序列存在差异。

研究表明,COI基因不同区段的进化速率差异会影响DNA条形码的鉴定[6,10]。Yang等[11]应用377bpCOI基因中央区段对粉螨进行物种鉴定,未扩增到热带无爪螨(Blomiatropicalis)的目的片段,且不同螨种所需退火温度差异较大；Khaing等[12]基于该中央区段的系统树表明建树结果不符合形态学分类,且部分粉螨的分类置信度较低。因此，仅基于377bpCOI基因中央区段对粉螨进行分类鉴定有一定局限性。

线粒体DNA的661 bpCOI基因5′端区段[13]被广泛用于痒螨、蠕形螨等螨类的物种鉴定[5-6]。目前尚未报道该基因区段对于粉螨的物种鉴定。因此,本研究探讨661 bpCOI基因5′端区段是否适合常见储藏物粉螨的物种鉴定,为构建粉螨DNA条形码数据库提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集、分离和形态鉴定 本研究样本采集于2019年5～7月安徽省部分地区的储藏物中(表1)。从样本中挑取单个成螨，进行纯培养。从培养标本中挑取成螨制成玻片标本，依据形态学特征进行鉴定[14]。另取成螨于70%乙醇溶液固定，存放于-20℃，备DNA提取。

1.2 DNA提取、PCR扩增、克隆和测序 参照文献[15]提取单只螨基因组DNA。扩增引物为COI基因5′端区段[13]：LOC1490 5′-TTTTCTACHAAYCATAAAGATATTGC-3′，HCO2198 5′-TATAAACYTCDGGATGNCCAAAAAA-3′，经PCR扩增、克隆测序后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3 序列分析 所获序列进行同源性比对。结合GenBank已知12条粉螨COI基因5′端序列，用ClustalX 1.83软件进行多序列比对，基于MEGA X软件[16]进行数据分析。以粒形硬蜱(lxodes granulatus)作为外群，构建Maximum Likelihood(ML)系统发育树。

2 结果

2.1 形态学鉴定 本次采集的粉螨隶属于5科6属7种,表中基因序列号均来自本实验的PCR测序剪切上传至Genbank，见表1。

表1 粉螨采集信息及基因序列号

2.2 分子鉴定 共获77条661 bp的粉螨COI基因序列，其中单倍型29条序列，并将序列上传至GenBank(表1)。所获序列经Blast比对显示，表2中5种粉螨分子鉴定结果与形态学结果一致；由于GenBank缺少拱殖嗜渣螨和纳氏皱皮螨相关序列，因此未能准确比对结果。

表2 获得序列在GenBank中Blast比对结果

2.3 碱基组成和变异位点 7种粉螨COI基因单倍型序列29条，结合GenBank已知12条粉螨COI基因序列(表3)。对10种粉螨的COI基因序列碱基组成分析可知，COI片段具有A/T含量偏向性。依据不同地理种群变异位点分析，结果显示种内变异位点小于种间。10种粉螨共检测到261个变异位点，400个保守位点，247个简约信息位点。

表3 GenBank中粉螨COI基因序列

2.4 遗传距离 依据不同地理种群遗传距离分析结果见表4。种内遗传距离小于种间，种间遗传距离大于种内10倍以上。

表4 10种粉螨的遗传距离分析

2.5 系统发育树 基于线粒体COI基因5′端区段，以粒形硬蜱(lxodesgranulatus)作为外群，使用MEGA X软件构建ML系统发育树(图1)。7种不同种属粉螨均能独立聚为一支，且支持率均达100%，与形态学分类一致。

*为本研究所获得的序列。

3 讨论

粉螨形态学鉴定容易受到螨体微小、形态不完整及环境变异等限制[3]，DNA分子标记可有效弥补形态学鉴定的不足[8]，常用于粉螨鉴定的线粒体COI基因具有适宜的进化速率，广泛用于亲缘关系较近的粉螨物种鉴定[7-9]。研究表明，基于377 bpCOI基因中央区段[11-12]探究粉螨种属关系尚存在一定限制。

本研究基于661 bpCOI基因5′端区段进行7种常见储藏物粉螨的物种鉴定，通过碱基组成分析，均存在A/T偏向性；进行变异位点和遗传距离分析，同种粉螨不同地理种群间序列差异较小，遗传距离均小于2%，说明661 bpCOI基因5′端区段不受地理种群影响；种内序列差异小于种间，种间遗传距离与种内之比大于10倍以上，符合Hebert等[4]提出的物种鉴定有效标准。说明该基因区段能较好地区别种属关系；同时结合系统发育树分析，7种不同种属粉螨均能独立聚为一支，与形态学鉴定一致。提示该基因5′端区段可用于7种常见储藏物粉螨的物种鉴定。

本研究首次提交了纳氏皱皮螨和拱殖嗜渣螨的661 bpCOI基因5′端区段序列，由于GenBank缺乏其相关序列信息，因此没有准确的比对结果。表明DNA条形码进行物种鉴定受数据库中信息不全的限制，亟待尽可能全地收集不同种类及地理种群的粉螨，完善661 bpCOI基因5′端区段的数据库，为构建DNA条形码数据库提供基础资料。