花榈木叶黄酮类化合物提取纯化工艺优化

朱仕豪，凌智辉，张湘龙，唐 其,2，陆 英,2

（1.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128；2.国家中药材生产（湖南）技术中心， 湖南 长沙 410128）

花榈木（Ormosia henryi Prain）为豆科红豆属常绿乔木，又名花梨木、臭桶柴、红豆树等，分布于我国安徽、浙江、江西、湖南、湖北、广东、四川、贵州、云南等地[1]。花榈木以根、根皮、茎及叶入药，全年可采，晒干备用或鲜用，主治跌打损伤、腰肌劳损、风湿关节痛、产后血瘀腹痛、白带、流行性腮腺炎、丝虫病；根皮外用治骨折，叶外用治烧伤、烫 伤[2]。目前，花榈木主要作为园林绿化树种，同时因其木材致密质重，纹理清晰美丽，多用于制作高档家具、装饰品以及文房诸器等，故对其研究主要集中在育种、施肥等方面[3-6]，而对其化学成分及药理作用的研究相对较少，Feng 等[7]从花榈木根皮中分离得到23 个化合物，并对其中的2 个化合物进行了抗氧化活性和抗癌活性研究。课题组前期研究发现，花榈木叶提取物中含有具抗抑郁活性的成分，从中分离鉴定得到8 个黄酮类化合物，采用UPLC- ESI-QTOFMS/MS 技术初步鉴定出46 种黄酮类化合物[8]。为进一步提高提取物中黄酮类化合物的含量，笔者对花榈木叶黄酮提取工艺进行优化，并通过静态吸附和解析对10 种大孔吸附树脂进行了筛选，再通过动态吸附试验对花榈木叶总黄酮的纯化工艺进行优化，旨在为花榈木叶进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试原料花榈木叶采于湖南省郴州市桂阳县湖南利诺生物药业有限公司，60℃烘干后粉碎，过20 目筛，密封保存备用。

主要试剂有芦丁标准品（纯度98%，上海源叶生物科技有限公司），无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司），HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM130、AB-8、D101、NKA-9、X-5 等10 种大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。

主要仪器有粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），101-1AB 电热鼓风干燥箱、HH-ZK8 电热恒温水浴锅（上海标和仪器有限公司），UV-2100 紫外分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线制作 采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法，精密称取干燥至恒重的纯度为98%的芦丁标准品8.14 mg，置于10 mL 容量瓶中，用70%的乙醇溶解，然后再加入70%乙醇定容至刻度，摇匀，精密吸取芦丁标准溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加70%的乙醇补充至2 mL；加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，摇匀后放置6 min；然后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4 mL，摇匀后再放置6 min；再加入5%的NaOH 溶液4 mL，最后用70%的乙醇定容，摇匀后放置10 min，在510 nm 波长处测定吸光值，重复测定3 次。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，获得线性方程y=12.415x-0.003 5（R2=0.999 6）。花榈木总黄酮得率（%）=样品中总黄酮的质量（g）/干物料的质量（g）×100。

1.2.2 花榈木叶总黄酮提取工艺优化 （1）花榈木叶总黄酮提取工艺流程：取1.0 g 花榈木叶原料加入提取溶剂后置水浴锅中提取一定时间，趁热过滤，定容至50 mL，取样检测。（2）单因素试验。分别对乙醇体积分数（0、30%、50%、70%、90%、100%）、料液比（1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50，g/mL）、提 取 温 度（30、50、70、80、90、100 ℃）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）4 个因素进行单因素试验。（3）正交试验。在单因素试验的基础上，分别在每个因素的最佳值附近选择3 个水平，然后进行4 因素3 水平的L9（34）正交试验，优化提取工艺。

1.2.3 花榈木叶总黄酮纯化工艺优化 （1）花榈木叶总黄酮的制备。取花榈木叶粉末，按1.2.2 中所得最佳工艺条件进行提取，55℃旋转蒸发浓缩至无乙醇味，然后用等体积石油醚萃取3 次，分离石油醚层后，取水相在55℃旋转蒸发，除去残留石油醚后测定总黄酮含量，冷藏备用，使用时用水稀释至所需浓度。（2）树脂预处理。将新购的大孔吸附树脂用95%乙醇充分浸泡溶胀24 h，湿法装柱，用蒸馏水洗涤至无乙醇味，备用。（3）树脂筛选。将10 种预处理好的大孔吸附树脂去除表面水分后，各精密称取2.0 g 至于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL 浓度为2.14 mg/mL 的花榈木叶总黄酮原料液，置于30℃恒温摇床，100 r/min 条件下振荡24 h，计算各型号树脂的吸附量。将充分吸附后的各型号树脂用少量蒸馏水冲洗，除去表面水分后，加入50 mL 70%的乙醇溶液，置于30℃恒温摇床，100 r/min 条件下振荡解吸24 h，计算解析量。根据吸附量和解吸量，选择最合适的树脂。（4）上样液浓度的确定。取浓度分别为0.43、0.86、1.29、1.71、2.14 mg/mL 的花榈木叶总黄酮原料液各150 mL，以3 BV/h 的流速分别通过装有50 mL AB-8 树脂的层析柱，进行动态吸附，收集流出液，对其中的总黄酮含量进行检测，筛选出最佳上样液浓度。（5）上样液pH 值的确定。取150 mL 浓度为1.71 mg/mL 的花榈木叶总黄酮原料液5 份，分别用冰乙酸或者NaOH 调节pH 值至2、3、4、5 和6，以3 BV/h 的流速分别通过装有50 mL AB-8 树脂的层析柱，进行动态吸附，收集流出液，对其中的总黄酮含量进行检测，筛选出最佳上样液pH 值。（6）上柱流速的确定。取150 mL 浓度为1.71 mg/mL 的花榈木叶总黄酮原料液5 份，将pH 值调节至3，分别以1、2、3、4、5 BV/h 的流速通过装有50 mL AB-8 树脂的层析柱，进行动态吸附，收集流出液，对其中的总黄酮含量进行检测，筛选出最佳上柱流速。（7）上柱体积的确定。将pH 值为3，浓度为1.71 mg/mL 的花榈木叶总黄酮原料液，以4 BV/h 的流速通过装有50 mL AB-8 树脂的层析柱，进行动态吸附，收集流出液，每50 mL 为一个流分，共收集16 个流分，对其中的总黄酮含量进行检测，确定最佳的上柱体积。（8）洗脱剂浓度的确定。取AB-8 大孔吸附树脂5 份，每份50 mL，按上述得到的最佳条件进行上样吸附，上样完毕后静置30 min，用150 mL 蒸馏水洗去杂质，用5 BV 体积分数分别为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液以3 BV/h 的流速洗脱，收集洗脱液，检测总黄酮含量，筛选出最佳洗脱剂浓度。（9）洗脱流速的确定。取AB-8 大孔吸附树脂5份，每份50 mL，按上述得到的最佳条件进行上样吸附，上样完毕后静置30 min，用150 mL 蒸馏水洗去杂质，分别用5 BV 体积分数80%的乙醇溶液以1、2、3、4、5 BV/h 的流速进行洗脱，收集洗脱液，检测总黄酮含量，筛选出最佳洗脱流速。（10）洗脱体积的确定。取AB-8 大孔吸附树脂50 mL，按上述得到的最佳条件进行上样吸附，上样完毕后静置30 min，用150 mL 蒸馏水洗去杂质，用体积分数80%的乙醇溶液以3 BV/h 的流速洗脱，每50 mL 收集一份洗脱液，检测总黄酮含量，筛选出最佳洗脱体积。（11）纯化效果验证。按上述所得最佳纯化工艺进行5 次重复试验，将洗脱液浓缩后冷冻干燥得花榈木叶总黄酮纯化产品，测定其总黄酮含量，以验证优化后工艺条件的纯化效果。

2 结果与分析

2.1 花榈木叶总黄酮提取工艺优化

2.1.1 单因素试验结果 如图1 所示，在乙醇体积分数70%、料液比1 ∶40（g/mL）、提取温度80℃、提取时间1.0 h条件下，各单因素试验的总黄酮得率最高，以此为基础，设计表1 的正交试验方案。

表1 正交试验设计因素及水平

图1 不同提取因素对花榈木叶黄酮得率的影响

2.1.2 正交试验结果 如表2 所示，从K 值可以看出，各因素不同水平对花榈木叶总黄酮化合物浸出的影响大小为A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C1＞C3＞ C2、D3＞D2＞D1。从极差（R）值可以看出，不同因素对花榈木叶总黄酮化合物浸出的影响大小为料液比＞乙醇体积分数＞提取时间＞提取温度。综合以上条件，确定花榈木叶总黄酮的最佳提取工艺为A1B2C1D3，即乙醇体积分数60%，料液比1 ∶40（g/mL），提取温度80℃，提取时间1.5 h。

由于最佳提取工艺组合未在正交试验设计的9 个组合中，因此需要对最佳提取工艺进行试验验证，重复5 次，花榈木叶总黄酮得率分别为2.81%、2.82%、2.85%、2.85%、2.84%，平均值为2.83%，相对标准偏差（RSD 值）为0.73%，高于其他试验结果，表明正交试验获得的最佳工艺组合是有效且可靠的。对该工艺制备得到的花榈木叶提取物经溶剂回收，冷冻干燥成粉末，测得提取物中总黄酮含量为15.95%。

表2 正交试验结果

2.2 花榈木叶总黄酮纯化工艺优化

2.2.1 树脂筛选 试验考察了10 种大孔吸附树脂的吸附/解吸性能，从表3 可以看出，HPD-100、HPD-400、AB-8、X-5 这4 种树脂都具有很好的吸附性能，吸附量均大于41 mg/g，这4 种树脂中AB-8 树脂的解吸量和解吸率均较高，最终选择AB-8 大孔吸附树脂纯化花榈木叶总黄酮。

表3 10 种大孔吸附树脂的吸附/解吸性能

2.2.2 上样液浓度对总黄酮吸附率的影响 由图2 可知，随着上样液浓度增加，吸附率不断增大，是因为随着浓度增加，分子越来越密集，与树脂接触并被吸附的概率越大；当上样液浓度为1.71 mg/mL 时，吸附率为87.54%，达到最高；而继续增加上样液浓度，吸附率开始下降，是因为浓度过大，上样液中的黄酮类物质还未被充分吸附即被滤出，导致吸附率降低。因此最佳上样液浓度为1.71 mg/mL。

图2 不同上样液浓度处理总黄酮的吸附率

2.2.3 上样液pH 值对总黄酮吸附率的影响 由图3可知，随着pH 值不断增大，吸附率呈下降趋势。黄酮类化合物因含有多个酚羟基而呈弱酸性，因而在酸性或者弱酸性条件下更容易与树脂产生氢键，从而被吸附。随着pH 值不断增大，黄酮类化合物容易转变成盐，因而不容易被树脂吸附，导致吸附率下降。由于pH 值为3 和pH 值为2 时的吸附率相差甚微，从经济角度考虑，选择将上样液的pH 值调为3。

图3 不同上样液pH 值处理总黄酮的吸附率

2.2.4 上样流速对总黄酮吸附率的影响 由图4可知，随着流速加快，吸附率越来越低。因为流速越慢，上样液流过树脂的时间越长，黄酮类物质与树脂接触更充分，从而更容易被吸附。流速为4 BV/h 与流速为1 BV/h 的吸附率相差不到1%，为了提高纯化效率，选择4 BV/h 的流速上样。

图4 不同上样流速处理总黄酮的吸附率

2.2.5 上样体积对总黄酮吸附率的影响 由图5可知，随着上样体积增加，流出液中泄漏出来的总黄酮量越来越大，当上样体积为5 BV 时，流出液中总黄酮浓度为0.18 mg/mL，稍大于上样液浓度（1.71 mg/mL）的10%；当上样体积达到13 BV 时，流出液中总黄酮浓度基本与上样液浓度持平，说明达到吸附饱和。考虑到效率和效益，最终选择上样体积为5 BV。

图5 不同上样体积处理流出液总黄酮的浓度

2.2.6 洗脱液体积分数对解吸率的影响 由图6可知，随着乙醇体积分数不断增大，解吸率越来越高，当乙醇体积分数达到80%之后，再增大乙醇体积分数对解吸率影响不大，为了节约成本，最终选择体积分数80%的乙醇溶液作为洗脱剂。

图6 不同洗脱剂体积分数处理总黄酮的解吸率

2.2.7 洗脱流速对解吸率的影响 由图7 可知，随着洗脱流速的加快，解吸率越来越低。洗脱流速过快，洗脱剂还未充分解吸树脂上吸附的黄酮就已经流出柱外，导致解吸率低；流速太慢，虽然能充分解吸，但是 周期过长，洗脱流速为3 BV/h 与流速为1 BV/h 的解吸率相差甚微，为提高效率，确定洗脱流速为3 BV/h。

图7 不同洗脱流速处理总黄酮的解吸率

2.2.8 洗脱液体积对解吸率的影响 由图8 可知，当洗脱液体积为4 BV 时，洗脱液中的总黄酮浓度已经降至很低，说明此时树脂所吸附的黄酮已基本洗脱完全，继续洗脱成本增加而得率不高，还不利于溶液的浓缩，因此确定洗脱体积为4 BV。

2.2.9 纯化效果验证 综合上述试验结果，总黄酮最佳纯化工艺参数如下：采用AB-8 大孔吸附树脂，上样液浓度1.71 mg/mL、上样液pH 值=3，以4 BV/h流速上样，上样体积5 BV 进行吸附，然后以80%的乙醇溶液按3 BV/h 的流速洗脱，洗脱体积为4 BV。按最佳纯化工艺条件重复试验5 次，将洗脱液浓缩后冷冻干燥成粉末，测得粉末中总黄酮含量分别为29.94%、28.91%、29.63%、30.24%、28.85%，平均值为29.51%，相对标准偏差（RSD 值）为2.09%。这表明经AB-8 大孔吸附树脂纯化后，花榈木叶提取物中总黄酮含量提高了约1 倍，实现了成分的富集。

图8 不同洗脱体积处理流出液总黄酮的浓度

3 结 论

研究利用正交试验得到回流提取法提取花榈木叶总黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数60%，料液比1 ∶40（g/mL），提取温度80 ℃，提取时间1.5 h。在此条件下，花榈木叶总黄酮得率为2.83%，将提取液冷冻干燥成粉末后，测得其总黄酮含量为15.95%。

通过比较10 种不同型号大孔吸附树脂的吸附率和解吸率，发现AB-8 大孔吸附树脂对花榈木叶总黄酮有良好的吸附与解吸性能，其最佳纯化工艺参数为上样液浓度1.71 mg/mL，上样液pH 值3，上样流速4 BV/h，上样体积5 BV，洗脱液为体积分数80%的乙醇溶液，洗脱流速3 BV/h，洗脱体积4 BV。经纯化后，花榈木叶提取物粉末中总黄酮含量由原来的15.95%提高至29.51%。