苯酚-硫酸法快速测定多糖方法的优化

罗春萍， 陆友利，王星星(台州科技职业学院，浙江 台州 318020)

0 引言

苯酚-硫酸法是常用的测定多糖含量的方法之一[1]，该方法利用多糖在浓硫酸作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，然后再与苯酚缩合生成具有紫外吸收特性的有色化合物进行比色测定，具有操作简单、显色组分相对稳定、重复性好等优点[2-3]。苯酚-硫酸法多采用紫外分光光度计进行检测，由于受到比色槽数量的限制，测定多个样品时，操作较繁琐，比较费时，且实验过程中消耗较多浓硫酸并产生大量废液，对操作人员和环境易造成危害[4]。酶标仪与紫外分光光度计的测试原理相同[5]，但具有96个比色槽，可批量完成多个样品的测定，大大提高检测效率。因此，本研究以酶标仪代替紫外分光光度计为测定仪器，以葡萄糖为标准品，通过实验优化苯酚-硫酸法测定多糖的反应条件，探索多糖批量快速检测的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；WD-2102A全自动酶标仪 北京六一生物科技有限公司；96孔单条可拆酶标板 海门捷泰实验器材有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 实验溶液的配制

(1)葡萄糖标准溶液的配制。精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准物质200mg，用蒸馏水溶解并定容至100mL，配成2.0mg/mL的葡萄糖标准品母液；然后分别移取0、1、2、3、4、5mL葡萄糖标准品母液，置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，摇匀，即得浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖标准溶液，避光保存备用。

(2)5%苯酚溶液的配制。取一个干燥小烧杯称取5g固体苯酚，加蒸馏水溶解并定容至100mL，转至棕色瓶中4℃保存备用。

1.2.2 检测波长的确定

移取100μg/mL的葡萄糖标准溶液1mL加入试管中，以1mL蒸馏水作空白，室温下加入5%苯酚溶液1mL、浓硫酸5mL，迅速摇匀后，置40℃水浴反应10min，冷水终止反应，紫外分光光度计扫描400～600nm波长范围的吸光度，以最大紫外吸收波长作为酶标仪检测的波长。

1.2.3 单因素试验设计

以100μg/mL葡萄糖标准溶液200μL为研究对象，酶标仪检测波长为490nm时的OD值作为评价指标，分别考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、浓硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反应温度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反应时间(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素对OD490nm值的影响[6]。

1.2.4 正交优化试验

在1.2.3单因素试验结果的基础上，选择苯酚用量(A)、浓硫酸用量(B)和反应温度(C)3个因素为自变量，以OD490nm值为评价指标，进行L9(33)正交试验，试验因素及水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 标准曲线制作

以蒸馏水为空白，分别精密吸取浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖标准品溶液各200μL加入2mL具塞塑料离心管中，在每支离心管中加入5%苯酚溶液200μL、浓硫酸700μL后，迅速摇匀，80℃水浴10min后，冷水浴5min终止反应，精密吸取各反应液加入96孔酶标板，每个样品加3个孔，每孔200μL，采用酶标仪在490nm波长下测定OD值，以葡萄糖浓度为横坐标，OD490nm值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 酶标仪测定多糖的可行性分析

精密吸取浓度为40、60、80、100μg/mL的葡萄糖标准品溶液各200μL加入2mL具塞塑料离心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、浓硫酸反应后，酶标仪测定OD490nm值，并根据标准曲线计算多糖含量。

2 结果与分析

2.1 酶标仪检测波长的确定

采用苯酚-硫酸法对葡萄糖标准品进行测定，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm波长范围内进行扫描，结果如图1所示，葡萄糖标准品在490nm处有最大吸收峰，故可选择490nm作为酶标仪检测波长。

图1 苯酚-硫酸法测定葡萄糖的紫外吸收光谱图

2.2 单因素实验结果

由图2(A～C)可知，苯酚用量为200μL、硫酸用量为700μL、反应温度为80℃时，OD490nm值最大；图2D可知，不同反应时间下，OD490nm值保持一个相对稳定的水平，说明葡萄糖与苯酚-硫酸能在较短时间内发生比较彻底的化学反应，生成物的量基本保持不变；为能保证化学反应完全，且便于实验操作，故选取实验反应时间为10min。

图2 苯酚用量

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，对苯酚用量、浓硫酸用量、反应温度三因素进行正交试验，结果如表2所示。

表2 正交试验结果

通过对R值的分析可知，RA＞RC＞RB，即各反应条件对OD490nm值的影响大小依次为苯酚用量＞反应温度＞浓硫酸用量。从K值的分析中可知，较佳的反应条件为A2B2C2，即苯酚用量200μL，浓硫酸用量700μL，反应温度80℃。

2.4 标准曲线绘制与检测结果

以葡萄糖浓度为横坐标，OD490nm值为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示，得到回归方程为y=0.0076x-0.01118，R2=0.9989，说明当葡萄糖浓度在 0～100μg/mL范围内，酶标仪测定结果线性关系良好。

图3 葡萄糖标准曲线

使用酶标仪测定不同浓度葡萄糖标准溶液的OD490nm值，并根据标准曲线计算出葡萄糖浓度，与已知浓度比较，结果如表3所示。从表中数据可以看，采用酶标仪测得的葡萄糖溶液的浓度与已知浓度非常接近，说明采用该方法测得的结果准确。

表3 酶标仪测得的葡萄糖溶液的浓度与已知浓度比较

3 结语

本研究以酶标仪代替紫外分光光度计，对苯酚-硫酸法测定多糖的反应条件进行优化，得出苯酚-硫酸法的最佳测定条件为：苯酚用量200μL、浓硫酸用量700μL、反应温度80℃、反应时间10min，以该方法反应绘制得到的标准曲线R2可达0.9989，且能得到准确可靠的测定结果，为多糖快速批量测定方法的开发提供了新策略。