耐砷真菌与芦苇联合对砷污染土壤修复作用的研究

杨金红

(新疆应用职业技术学院 园林园艺系，新疆 奎屯 833200)

土壤污染的植物修复技术具有成本低、污染少、操作简单以及不破坏土壤结构等优点，近年来受到了人们的广泛关注,其主要被应用于受重金属污染物污染的土壤修复。植物修复主要依靠污染土壤中重金属的可利用性进行土壤污染修复,然而对于植物来讲,重金属的可利用性经常受土壤与金属络合的影响。土壤微生物被公认为微生物螯合剂,因其具有活性强等优点,可通过自身或产生代谢产物促进植物根系发育并增加生物量,从而提高植物对不同环境压力的耐受力,改变土壤中重金属形态,增加重金属的生物可利用性,强化植物的修复效率[1][2]。因此微生物与植物联合修复具有广泛的应用前景。

土壤砷(As)污染是全球关注的环境问题之一,国内受As污染的农田及场地土壤面积较大。植物修复是受广泛关注的重要方法之一,借用微生物,进一步提升修复植物富集砷的能力是近期国内外研究的重点。赵根成等研究发现,施用放线菌PSQ、shf2和细菌Ts37、C13处理能明显促进蜈蚣草的生长,放线菌PSQ、shf2和细菌Ts37、C13处理在45 d内植物修复效率为8.9%～11.3%；施用微生物可明显提高蜈蚣草累积砷的能力[3]。文一等也报道了链霉菌Streptomycessp.具有较强的抗砷毒害能力,能促进根际土壤中 As(Ⅴ)还原成As(Ⅲ),大幅度降低根际土壤残渣态砷含量,增加砷的生物可利用性,且能促进植物对砷的吸收[4]。白建峰等筛选出2株细菌和2株真菌,这4个菌种均能显著增加土壤中非专性和专性吸附态As的含量,显著增加土壤中活性态可迁移性As含量,且都能产生IAA,有利于植物修复As污染土壤,可被应用于微生物-植物联合修复As污染土壤工程[5]。

新疆奎屯垦区是我国首次发现的地方砷中毒病区[6]。据有关报道，奎屯垦区土壤砷含量平均值为19.3 mg/kg[7]。芦苇(Phragmitesaustralis)对Pb、Zn、As、Hg具有较好的耐性及富集能力[8，9]。芦苇对土壤pH值适应范围较广,对盐碱土有较强的耐受能力,植株生长迅速且生物量大,因此在重金属污染区域的生态修复中有着较好的应用前景[10]。为了提高芦苇的修复效率,笔者将耐砷真菌接种到芦苇根际,研究了耐砷真菌联合芦苇对土壤砷的吸收累积效果,分析了土壤中砷的吸收转运规律,以期为微生物联合植物修复土壤中的砷污染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试盆栽土 土壤取自新疆应用职业技术学院实验基地。将所取土壤去除杂物并风干,用孔径为2 mm的尼龙筛过筛,再用4%福尔马林熏蒸消毒,放置两周后待用。土壤类型为盐化潮土,全氮含量为0.56 g/kg,全磷含量为0.68 g/kg,全钾含量为19 g/kg,有机质含量为10.5 g/kg,砷含量为21.35 mg/kg, pH 8.3。

1.1.2 供试芦苇 从新疆奎屯垦区无砷污染土壤中取野生芦苇,将较大植株分成长势及大小基本一致的带根的植物体；剪除地上部分茎叶,将这些带根的植物体分别栽种在口径为18 cm的小盆钵(装有机土1 kg)中,每盆4株,浇水保持盆土湿润,在生长箱(25 ℃，每天光照16 h)中育苗2周。

1.1.3 供试菌株及菌液的制备 从新疆奎屯垦区123团附近采集土壤及植物样品,采用富集培养的方法进行菌株的分离,得到4株耐砷真菌,将这些菌株保存在新疆应用职业技术学院微生物实验室。供试菌株为：KT-1，属于青霉属Penicillium(菌种特征:培养3 d时菌落直径33 mm,菌落圆形,黄绿色,边缘颜色变浅；分生孢子梗短,顶端膨大,分生孢子近球形。)；KT-2，属于青霉属Penicillium(菌种特征:培养3 d时菌落直径15 mm,菌落边缘白色,中央蓝绿色,有较多的淡黄色渗出液；分生孢子梗光滑,分生孢子椭圆形。)；KT-3，属于木霉属Trichoderm(菌种特征:培养3 d时菌落直径90 mm；菌丝絮状,初期白色,逐渐形成密实产孢丛束,排成同心轮纹,深绿色；厚垣孢子球形，多生于基底菌丝中,分生孢子多球形。)；KT-5，属于芽枝霉属Ladosporium(菌种特征:培养3 d时菌落直径10 mm,菌落圆形,褐绿色,绒状,中央有坚硬凸起,菌落背面蓝黑色；分生孢子暗色,椭圆形。)[11]。以上菌株分别简称为K1、K2、K3、K5。取4种菌株各1株,接种在PDA的液体培养基上[12],在25 ℃摇瓶中培养6 d。

1.2 试验设计

砷以As2O3的形式加入,在前期实验中,设置6个土壤砷浓度处理,当土壤砷浓度为50 mg/kg时,芦苇的干鲜重在各浓度处理中最大[13],故本次实验设置土壤砷含量为50 mg/kg；将添加外源砷的土壤装入直径20 cm、高18 cm的小盆钵(装有机土2 kg)中,加水使土壤含水量饱和并充分混匀,平衡2周待用。

盆栽实验共设6个处理,分别是不添加菌且无植物的空白对照组(CK)、不添加菌但种植芦苇的植物对照组(CK+P)、K1菌液且种植芦苇的处理组(K1)、K2菌液且种植芦苇的处理组(K2)、K3菌液且种植芦苇的处理组(K3)、K5菌液且种植芦苇的处理组(K5)；每个处理设3个重复。选取长势一致的芦苇苗移栽至装好土且添加外源砷50 mg/kg的塑料盆中,移栽14 d确保存活后,在CK、CK+P对照组中施入30 mL无菌的真菌培养液,在K1、K2、K3和K5处理组中各施入30 mL活性菌液。在生长90 d后收获芦苇及盆内土壤,晃动芦苇根部,使不粘附根的土壤掉落,作为非根际土；用软毛刷刷下粘附在根际的土壤，作为根际土。

1.3 测定方法

芦苇植株培养90 d后从盆中移除,将芦苇全株用自来水洗净,并用吸水纸吸干水分,将芦苇全株分为地上部分和地下部分,将地上、地下部分分别放入烘箱,在105 ℃下杀青30 min,再在70 ℃条件下烘干8 h至恒重,分别称量地上、地下部分干重。

将土壤样品自然风干,将较大块土壤用木棍碾磨,再用研钵研碎,过100目筛。将植株叶、根、地上茎、地下茎样品，以及非根际土壤、根际土壤样品均送至谱尼测试集团北京实验室，进行总砷含量的检测,采用的测定方法参照GB/T 5009和GB/T 515618。

1.4 数据处理

利用Excel和Spss 19.0统计软件对实验数据进行差异显著性检验及作图分析。

2 结果与分析

2.1 耐砷真菌对芦苇干重的影响

在添加外源砷50 mg/kg的条件下,土壤接种耐砷真菌后,与对照(CK+P)相比,添加微生物处理的芦苇地上部及地下部分干重均有所提高(图1)。接种K2的芦苇地上部分的干重有显著增加(P<0.05),为13.0 g,比对照CK+P(9.19 g)增加了3.81 g;接种K3的芦苇地下部分的干重有显著增加(P<0.05),为12.2 g,比对照CK+P(8.54 g)增加了3.66 g。

同一指标不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图1 耐砷真菌对芦苇地上、地下部干重的影响

2.2 耐砷真菌对芦苇吸收与分配砷的影响

表1显示：在接种K1、K2、K3和K5菌株后,芦苇地上茎、地下茎及根的砷含量均高于不接种耐砷真菌的对照组(CK+P)；特别是接种K3的实验组的植株地下茎吸收砷量显著提高,其地下茎的砷含量(6.18 mg/kg)比对照CK+P(3.65 mg/kg)提高了69.3%,差异达到了显著水平(P<0.05)；接种K1、K2和K5的芦苇地下茎的砷含量分别为4.20、5.40、3.70 mg/kg(对照为3.65 mg/kg);接种K1、K2、K3和K5的芦苇地上茎的砷含量分别为2.83、3.05、4.98、2.66 mg/kg(对照为2.38 mg/kg);接种K1、K2、K3和K5的芦苇根的砷含量分别为16.60、22.60、23.50、10.60 mg/kg(对照为10.40 mg/kg)。说明耐砷真菌对芦苇吸收土壤砷有较强的强化作用,可有效提高芦苇对砷的富集能力,其中菌株K3被添加到芦苇地下部分时,其强化作用更加显著。

表1 耐砷真菌对芦苇各部位砷含量的影响 mg/kg

2.3 耐砷真菌联合芦苇对土壤砷吸收的影响

在接种K1、K2、K3和K5后,根际土和非根际土壤中的砷含量如表2所示,空白对照CK的土壤砷含量为(69.7±5.19)mg/kg；施用耐砷真菌联合芦苇修复含砷土壤,非根际土中的砷含量大于根际土的砷含量；对照CK+P根际土和非根际土的砷含量均高于施菌联合芦苇处理的土壤砷含量。其中接种K2和K3菌株的非根际土壤砷含量与对照CK+P相比差异显著(P<0.05),接种K2和K3的芦苇非根际土的砷含量分别为52.9和52.6 mg/kg,较对照CK+P(68.2 mg/kg)分别降低了22.5%和22.9%;接种K2菌株的芦苇根际土壤砷含量与对照CK+P相比差异显著(P<0.05),接种K2的芦苇根际土砷含量为38.1 mg/kg,较对照CK+P(57.7 mg/kg)下降了33.9%。

表2 不同处理土壤中的砷含量、土壤砷去除效率及富集系数

微生物联合芦苇修复90 d后,土壤中砷的去除效率如表2所示,接种耐砷真菌的根际土和非根际土中砷去除效率均比对照CK+P高,对照CK+P对非根际土中砷的去除效率为2.20%,接种K1、K2、K3和K5的芦苇非根际土的砷去除效率较CK+P分别提高了7.90、22.01、22.40、1.24个百分点；对照CK+P对根际土中砷的去除效率为17.30%,接种K1、K2、K3和K5的芦苇根际土的砷去除效率分别较CK+P提高了10.20、28.00、21.90、12.30个百分点。说明接种耐砷真菌联合芦苇可以提高土壤砷的去除效率,其中接种菌株K2、K3的非根际及根际总砷的去除效果最好。

微生物联合芦苇修复90 d后,接种K1、K2和K3的芦苇的砷富集系数(根砷含量/土壤砷含量)均高于同期CK+P的,其中K3处理的砷富集系数最大，达0.34,为CK+P的2.27倍；K2处理的砷富集系数次之，为0.32,为CK+P的2.13倍。

3 讨论

由于植物根系分泌物的作用,植物根系含有较多的碳水化合物、氨基酸、生长因子等物质,可以使其成为微生物旺盛生长的区域；当用植物修复重金属污染土壤时,微生物也会发挥重要的作用,因此植物根系微生物对植物生长、吸收重金属及转运影响很大。在前期实验中,我们发现芦苇具有较好的耐砷性能,且生长快,适应性强,但对砷的积累富集能力较低[14]。在本实验中，接种K2的芦苇地上部分干重有显著增加,比对照CK+P增加了3.81 g;接种K3的芦苇地下部分干重也有显著增加,比对照增加了3.66 g,表明耐砷真菌K2、K3可以明显提高芦苇的生物量。有研究认为微生物在旺盛的生命活动代谢过程中,可以分泌出大量的次生代谢产物,分泌的植物激素如细胞分裂素、赤霉素等可以促进植物根系的生长[15]；微生物的活动可增加植物生物量,提高植物对不同环境压力的耐受力[16]。有关资料显示，在植物修复中,植物生物量的高低对土壤修复速率及效果也有显著影响,朱岗辉研究发现微生物菌剂能显著提高蜈蚣草的修复效率,施加菌剂后蜈蚣草地上部生物量提高了16.8%，蜈蚣草地上部砷吸收量比对照提高了41.1%[17]；陈苏等研究发现，当土壤中污染物种类和含量相同时,加入土霉素降解菌有利于提高紫茉莉和孔雀草的生物量,并可促进紫茉莉和孔雀草各部位对镉的富集并提高其富集系数[18]。本研究发现，通过添加耐砷真菌联合芦苇修复砷污染土壤,耐砷真菌可提高芦苇的生物量，进而提高修复效果。

多数研究表明微生物联合植物修复重金属污染土壤,可有效提高植物吸收转运重金属的能力,提高修复效率。靳治国[19]研究发现,在复合污染土壤中,添加淡紫拟青霉菌和绿色木霉菌混合菌液不仅能促进龙葵生长,还能提高龙葵对Cd和Pb的富集能力。王立等[20]研究发现,在Cd污染土壤中接种丛枝菌根真菌,有助于提高水稻对Cd的耐受性。李世阳[21]在实验室对芦苇接种菌根进行了研究,发现虽然不同接种时间和不同接种量对芦苇的侵染率影响不大,但是侵染率均较天然状态显著提高,平均侵染率均高于70%,而且生物量也明显高于空白对照。盆栽试验结果表明，有侵染的盆栽对高锰酸盐的净化效果高于无侵染盆栽,菌根真菌植物复合系统应用于生态修复技术是完全可行的。李丹[22]研究发现添加了微生物后芦苇对Cd、Pb的积累量有所提高,说明微生物能够促进芦苇对Cd、Pb的富集。本研究结果显示：在接种耐砷真菌后,芦苇地上茎、地下茎及根的砷含量均高于不施用耐砷真菌的对照组CK+P；接种K3的地上茎、地下茎吸收砷量均较对照CK+P显著提高;根际土中的砷含量小于非根际土的砷含量,根际土和非根际土中的砷含量均小于对照CK+P中的含量；接种K2和K3菌株的根际及非根际土壤的砷含量与对照CK+P相比差异显著。说明耐砷真菌对芦苇吸收土壤中砷有较强的强化作用,能有效提高植株对砷的富集能力,其中菌株K2和K3的强化作用更加明显。微生物能促进植物吸收及运转土壤砷的可能原因有：一是微生物能促进植物对土壤中营养元素与重金属的吸收[23]；二是微生物通过分泌生长调节剂和保护植物的抗生素、抑菌剂和螯合剂等方式增强了植物对污染环境的适应能力[24],从而提升了植物修复砷的能力。

微生物主要通过促进植物在重金属胁迫环境下的营养吸收及生长、增强植物抗逆性及提高植物根部重金属含量的方式提高植物的修复能力,促进植物提取或固定土壤中的重金属,从而起到强化植物修复的作用。本研究发现耐砷真菌和芦苇联合可提高As污染土壤的修复效率,因此采用农艺强化措施提高耐砷菌与芦苇联合对As污染土壤的修复效率是进一步深入研究的重点。