“聊红椿”提取物对非小细胞肺癌的抑制作用

张泽鑫，李 攀，马晓瑞，谢 芳，魏洪帅，朱艳娟，冀芦沙

(1.聊城大学 药学院,山东 聊城250059；2.银川市疾病预防控制中心，宁夏 银川750000)

0 引言

根据影像学和病理学分类，肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌又可以分为肉瘤样癌、腺癌、鳞状细胞癌和大细胞未分化癌等，其发生概率占总肺癌患者的80%-85%[1]。现阶段对于非小细胞肺癌的治疗主要以西医为主，其中I，II，III A期治疗以手术切除为主，如果没有发生转移，那么切除后就不考虑术后辅助治疗；如果发生转移，则会采取术后辅助治疗，比如化疗辅助。对于高危的III B期和IV期，主要采取全身治疗，目的是为了减轻患者痛苦，提高其生活质量，延长其生存期[2]。近年来，随着中医的发展，越来越多的患者倾向于采取中西医结合治疗的策略。患者手术后会通过服用一些补气益血的中医药来恢复机体正气，增加机体免疫力，减少术后癌细胞转移的风险。患者在进行放疗、化疗或者分子间靶向治疗以及免疫疗法时，也可以服用一些中医药。一是，可以减轻其毒副作用对机体的伤害；二是,一些中医药有增强敏感性作用，能够提高治疗效果。对于一些肺癌晚期患者，手术治疗和辅助治疗已经没有意义，此时也可以采取中医药治疗。一是减轻患者疼痛感；二是提高患者生存质量；三是延长患者生命[3]。肺癌是一种常见性的恶性肿瘤，其发病率和致死率呈现逐年上升趋势。根据预测，到2025年，我国每年将会有100万新发肺癌患者，每年高达90万人会死于肺癌，那时我国将成为肺癌大国[4]。因此，寻找治疗肺癌的有效方法显得格外重要。本研究中，我们通过从“聊红椿”中提取有效成分，作用于非小细胞肺癌A459细胞系和肺癌肿瘤模型小鼠，发现其对非小细胞肺癌具有显著活性，这为将来对非小细胞肺癌的治疗提供了新思路。

1 材料

1.1 药物

“聊红椿”提取物由本实验室通过有机溶剂萃取法提取，并通过旋转蒸发仪蒸干浓缩，再用常规水煎，浓缩至0.20 mg/mL，分装到EP管中，置于4 ℃冰箱保存，用于后续研究。非小细胞肺癌治疗药物顺铂(Cisplatin，DDP)，购买于齐鲁制药有限公司，产品批号为：411016CE，含量为20 mg/瓶，用细胞等渗浓度生理盐水稀释为0.367 mg/mL。

1.2 动物

选取60只SPF级雄性小鼠，鼠龄6-8 w，重量20 ± 2 g，购买于江苏省常州卡文斯实验动物有限公司，合格证号为：SCXK(苏)2011-0003，饲养于聊城大学药学院实验室动物房，室温控制在25 ℃，空气湿度保持为70%，采用国家标准饲料喂养，实验过程中小鼠采取自由饮食和饮水。

1.3 细胞株

人肺腺癌细胞系A549 购自美国ATCC公司，编号 CCL-185，培养于含有100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，置于温度设定为37 ℃，CO2含量为50 mL/L的细胞培养箱中培养。

1.4 试剂

臭椿酮，购买于上海乔羽生物科技有限公司，分析纯；MTT(四甲基偶氮唑盐)，购买于上海Sigma公司；胎牛血清和DMEM培养基均购买于Gibco公司；RNA提取液Trizol，cDNA反转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒均购买于大连TaKaRa公司；细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC购买于江苏碧云天公司；β-actin、 Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved PARP基因引物由上海生工公司合成；裂解 DNA 修复酶(cleaved PARP)购买于美国Abcam公司；兔抗人β肌动蛋白 (β-actin) 抗体、兔抗人 Bcl-2 抗体、兔抗人裂解型caspase-3 (cleaved-caspase-3) 抗体和兔抗人 Bax 抗体均购买于万类生物科技公司；甲醇、甲酸等有机试剂购买于国药集团化学试剂有限公司。

1.5 仪器

液相色谱LC-20A购买于日本岛津；荧光定量PCR Prism 7300购买于美国ABI公司；CO2恒温细胞培养箱FormaSeries和酶标仪Multiskan FC均购买于美国Thermo Fisher Scientific公司；倒置显微镜CKX-41购买于日本Olympus公司；流式细胞仪FACS CaliburTMFlow Cytometer REF 34295购买于美国BD公司；低温高速离心机Eppendorf Centrifuge5810R购买于德国Eppendorf公司；电泳仪及转膜仪Mini PROTEAN 3 Cell购买于美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统Tanon NIM2045购买于中国Tanon公司。

2 方法

2.1 “聊红椿”有效成分提取

(1) 称取新鲜“聊红椿”和野生型臭椿翅果150 g；(2) 液氮冷冻后研磨成粉末，加入少许无水乙醇使其充分溶解；(3) 加入200 ml蒸馏水，超声处理20 min；(4) 将其转移到旋转蒸发仪中，旋转蒸发浓缩成粉末状;(5) 称取0.1 g粉末将其置于1.5 mL EP管中，加入1 mL 75%乙醇，室温下旋转震荡抽提12 h；(6) 室温，12000 rpm，离心10 min，将上清液转移到新的EP管中；(7) 用0.22 μm 微孔滤膜过滤，将其转移到HPLC上样小瓶中，制备成待测样品，用于后续HPLC检测。

2.2 HPLC检测

色谱仪为岛津LC-20A仪器；色谱柱为XTerra (2.1 X 150 mm，C18)；流动相 A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液；流速：1.0 mL/min；检测波长：240-600 nm；柱温：常温；进样量：20 μL；洗脱梯度：0 min A相 10%，B相 90%；20 min A相65%，B相 35%；22 min A相10%，B相 90%；35 min 停止。

2.3 细胞培养

A549细胞株系用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，放置于5% CO2的培养箱中,37 ℃静置培养。取A549对数生长期的细胞，采用0.25 %胰蛋白酶消化后进行相关细胞实验。

2.4 MTT检测

将上述培养和处理后的细胞接种到96孔板中，每孔100 μL，细胞密度保持5000个左右。将不同浓度的“聊红椿”提取物加入到96孔板中，培养不同时间，设置3个重复。每孔中加入10 μL 5 g·L-1的MTT溶液(PBS缓冲液配制)，孵育4 h，倒掉上清液。每孔中加入100 μL DMSO，震荡反应10 min。测定其吸光度，检测波长为490 nm，计算并统计A549细胞增殖抑制率。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

选取对数生长期的A549细胞，将不同浓度的“聊红椿”提取物加入到96孔板中，培养24 h，每个浓度设置3个重复。具体步骤按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测说明书进行操作[5]。

2.6 Real-Time PCR检测相关基因表达

(1) 总RNA提取：采用有机试剂Trizol萃取法，具体步骤参考Trizol提取试剂盒；(2) cDNA反转录：具体步骤参考TaKaRa反转录试剂盒；(3) Real-Time PCR：具体步骤参考TaKaRa 荧光定量PCR试剂盒。

2.7 Western blot检测相关蛋白表达

选取对数生长期的A549细胞，将不同浓度的“聊红椿”提取物加入到96孔板中，培养24 h，每个浓度设置3个重复。提取各组细胞总蛋白后，按照相关方法和步骤检测相关蛋白的表达。

2.8 肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型建立

选取对数生长期的A549细胞，将0.25 %胰蛋白酶消化后，将其制成1×108/mL的细胞悬浮液。将其通过注射方式接种0.2 mL到裸小鼠右侧颈背交界处皮下，待裸小鼠皮下肿瘤长成即为模型构建成功[6]。

2.9 分组及给药

裸小鼠模型构建过程中，选取60只小鼠，将其分为6组，每组10只，模型对照组(MC group)，裸小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.5 mL；阳性药物治疗组(DDP组)，裸小鼠注射0.5 mL DDP稀释液；低剂量提取物组(L group)，注射1.0 mg/kg的“聊红椿”提取物；中剂量提取物组(M group)，注射2.0 mg/kg的“聊红椿”提取物；高剂量提取物组(H group)，注射4.0 mg/kg的“聊红椿”提取物；联合组(LC group)，注射0.5 mL DDP稀释液和2.0 mg/kg的“聊红椿”提取物。注射方式为腹腔注射，每3天注射1次，共注射14次，总计实验进行6 w。6 w后，处死肿瘤小鼠，摘下肿瘤，测量小鼠体质量和肿瘤直径。

表1 “聊红椿”提取物对A549细胞增殖的抑制影响

2.10 统计学分析

本研究中所有实验数据均需要通过SPSS19.0统计学软件进行统计学处理，数据呈现方式为平均数±标准差(x±s)。各组数据之间采用t检验，当P< 0.05时，表示差异显著，有统计学意义[7]。

3 结果

3.1 “聊红椿”有效成分HPLC检测

结果如图1所示，与野生型相比，“聊红椿”中有效成分臭椿酮含量显著高于野生型。鉴于之前的报道，臭椿酮具有很好的抗癌活性。接下来的研究中，我们重点将“聊红椿”提取物作用于非小细胞肺癌，研究其作用效果和分子机制。

图1 “聊红椿”有效成分HPLC检测

3.2 “聊红椿”提取物对A549细胞增殖的抑制影响

结果如表1所示，不同剂量“聊红椿”提取物组作用A549细胞株系后，A549细胞生长受到非常显著的抑制，且作用时间越长，剂量越高，其抑制效果越好。

3.3 “聊红椿”提取物对A549细胞凋亡的影响

结果如图2和表2所示，与对照组相比，不同剂量“聊红椿”提取物作用A549细胞株系后，A549细胞凋亡率明显增加，且具有显著的剂量依赖性。

图2 “聊红椿”提取物对A549细胞凋亡的影响

表2 “聊红椿”提取物对A549细胞凋亡的影响

3.4 “聊红椿”提取物对A549细胞中相关基因表达的影响

结果如图3所示，与对照组相比，“聊红椿”提取物处理后，A549中细胞凋亡因子Caspase-3，Bax，cleaved PARP的mRNA含量显著下降，抗凋亡因子Bcl-2 mRNA含量显著增加。

图3 “聊红椿”提取物对A549细胞中相关基因表达的影响

3.5 “聊红椿”提取物对A549细胞中相关蛋白表达的影响

结果如图4所示，“聊红椿”提取物对A549细胞中细胞凋亡因子蛋白水平表达的影响与mRNA水平一致。与对照组相比，Caspase-3，Bax，cleaved PARP的蛋白水平显著下降，抗凋亡因子Bcl-2的蛋白水平显著增加。

图4 “聊红椿”提取物对A549细胞中相关蛋白表达的影响

3.6 “聊红椿”提取物对裸小鼠体质量及肿瘤直径的影响

结果如表3所示，“聊红椿”提取物对各组小鼠体质量影响不显著，但是显著影响裸小鼠肿瘤直径，且具有剂量依赖性。

表3 “聊红椿”提取物对裸小鼠体质量及肿瘤直径的影响

4 讨论

臭椿Ailanthus altissima(Mill.)Swingle，属于落叶乔木，也叫椿树或木砻树。因其叶基部有腺点，易发散出臭味而得“臭”字。中医研究表明，臭椿树皮、根皮和荚果等都是中药材，具有止泻、止血、清热燥湿等功效[8]。“聊红椿”从聊城大学农学院臭椿培养基地中发现的一株稳定遗传的臭椿株系，其荚果呈现红色。臭椿酮(Ailanthone)是从臭椿中提取分离出来的一种苦味素类化合物，研究发现其有多种生物活性，如抗过敏、抗HIV、抗炎症、抗疟疾、抗微生物和抗溃疡等[9]。现代药理学研究发现，臭椿酮还具有抗癌症、抗病毒和抗结核病等生物活性[10]。近年来关于臭椿酮抗癌活性的报道越来越多，如Zhou Z等研究发现，臭椿酮可以通过抑制细胞周期蛋白和CDKs的表达，诱导p21和p27的上调表达，进而使得肝癌细胞处于G0/G1期阻滞，最终促进细胞凋亡发生[11]。He Y等研究发现，臭椿酮还具有克服药物治疗前列腺癌所产生的耐药性，同时还具有抑制前列腺癌肿瘤细胞的增殖，其作用机制主要是通过直接结合p23，进而抑制AR(雄激素受体)与HSP90(热休克蛋白90)的互作，使得AR蛋白发生不可逆降解，抑制下游基因的表达，从而达到治疗前列腺癌的目的[12]。本研究中，我们通过有机试剂萃取法，HPLC分析发现“聊红椿”中主要有效成分为臭椿酮，且其含量远高于野生型臭椿，这个结果说明“聊红椿”提取物可能比野生型臭椿株系中医药活性更好。

研究发现臭椿酮及其衍生物还具有很好的抗肺癌功效，其在细胞水平和动物水平抗肺癌主要是通过泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)，抑制下游相关基因表达[13]。当UPP生物学行为发生异常时，会造成恶性肿瘤的发生，这主要是由于当UPP蛋白异常时，会造成细胞内与UPP相关的重要功能蛋白发生降解，进而造成细胞内代谢紊乱[14]。Ni Z等研究发现，臭椿酮可以在体外抑制非小细胞肺癌细胞的生长，体内抑制皮下移植瘤的生长，能够显著延长荷瘤小鼠的生存质量和生存期。对其机制进行研究，发现臭椿酮主要是通过下调RPA1(复制蛋白A1)的蛋白表达，抑制DNA复制的发生，进而抑制非小细胞肺癌细胞的生长[15]。本研究中，我们将“聊红椿”提取物作用于非小细胞肺癌细胞，发现“聊红椿”提取物能够显著抑制A549细胞增殖和促进细胞凋亡发生，具有剂量依赖性。荧光定量PCR和Western blot实验发现，“聊红椿”提取物能够降低细胞凋亡因子Caspase-3，Bax，cleaved PARP的mRNA和蛋白水平的表达，增加抗凋亡因子Bcl-2 mRNA和蛋白表达，具有剂量依赖性。体外成瘤实验显示，“聊红椿”提取物能够明显降低肿瘤细胞直径，抑制效果与浓度呈正比。

总之，本研究从一个新的突变株系“聊红椿”中提取出有效成分，发现其中有高含量的臭椿酮，且对非小细胞肺癌具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡作用。对其机制研究发现，其通过细胞凋亡因子起作用。但是本研究仍有不足之处，如“聊红椿”中提取物如何起作用，后续仍需要大量研究去确定。