UFLC-MS/MS法测定句容蝉花中核苷类成分肌苷、尿苷的含量

杨燕飞 顾 媛 刘 源 窦金凤

江苏省镇江市食品药品监督检验中心，江苏 镇江 212000

蝉花别名冠蝉(《纲目》引《礼》注)、虫花《四川中药志》、蝘花《新华本草纲要》，为麦角菌科棒束孢属真菌蝉棒束孢菌的孢梗束、虫草属真菌大蝉草的子座及其寄生的虫体[1]。其味甘、性寒、疏散风热、熄风止痉、明目退翳[2]。研究发现，蝉花含有含肝糖、虫草酸、多种必需氨基酸、D-甘露醇、多种生物碱、麦角甾醇等有效成分。具有调节神经系统、增强免疫、抗炎、抗菌等保健和药用活性[3]。

核苷类成分对人体免疫、代谢、心血管等有重要生理作用，具有抗菌等活性[4-8]，有研究表明尿苷有预防细胞损害和肝脏机能失调的作用，肌苷有助于受损肝细胞功能的恢复，促进肝细胞的活化，提高肝脏功能。核苷的测定方法有薄层色谱法[9]、毛细管电泳法[10]、高效液相色谱法[11]，其中以HPLC法较为普遍。目前，蝉花的质量标准在浙江、四川等省有收载，内容仅包括性状、鉴别和检查项。由于镇江市句容地区环境适合蝉花的生长，而江苏省目前未收载蝉花标准，故本文采用超高效液相色谱-质谱联用(Ultra fast liquid chromatography-mass- mass spectrometry，UFLC-MS-MS)方法对句容蝉花中核苷类成分肌苷、尿苷进行含量测定，为蝉花的质量评价提供方法和依据，对句容蝉花进一步开发利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Shimadzu LC-MS-MS-8050(日本岛津，含LC-30AD二元高压泵， DGU-20A在线脱气机，CTO-30A柱温箱，SPD-M30A二极管阵列检测器，三重四级杆质谱仪；CPA225D电子天平(赛多利斯公司，精度为0.01mg)。

1.2 试药 肌苷对照品(中国食品药品监督检验研究院 批号140669-201606，98.6%)，尿苷对照品(中国食品药品监督检验研究院 批号110887-201803，99.5%)，甲醇为质谱纯，水为Milli-Q超纯水。6批蝉花均采收于句容茅山，由江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为Cordycepscicadae。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 对照品溶液的制备 分别精取肌苷13.79 mg、尿苷10.53 mg，加水溶解稀释至100mL容量瓶中，作为对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品约0.10 g(过四号筛)，置50 mL量瓶中，加水40 mL超声30 min，定容至刻度，摇匀，滤过，精取续滤液1 mL，稀释至50 mL容量瓶中，作为供试品溶液。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件 Shim-pack XP-ODSⅢ(2.0 mmI.D×75 mm，1.6 μm)为色谱柱；流动相：水-甲醇(95∶5)，柱温：40℃，流速：0.2 mL·min-1，进样量：1μL。

2.2.2 质谱检测条件 离子化模式：电喷雾离子化(ESI)，正离子模式；扫描模式：多反应检测(MRM)；离子喷雾电压：+4.0KV；ESI源温度：300℃；脱溶剂温度：250℃；加热块温度：400℃；雾化气流速：氮气，3.0 L·min-1；干燥气流速：氮气，10.00 L·min-1；碰撞气：氩气。MRM优化参数见表1，图谱如图1、2、3所示。

表1 MRM优化参数

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线的制备 分别精密量取对照品储备液适量，稀释成含肌苷2.04 ng·mL-1、4.08 ng·mL-1、5.44 ng·mL-1、6.80 ng·mL-1、9.52 ng·mL-1、13.60 ng·mL-1和尿苷15.72 ng·mL-1、31.44 ng·mL-1、41.92 ng·mL-1、52.40 ng·mL-1、73.36 ng·mL-1、104.80 ng·mL-1的混合对照品溶液。分别进样，以峰面积与浓度计算标准曲线。肌苷的回归方程为Y=2.53207×103X+180.804，R2=0.9941，尿苷的回归方程为Y=324.641X+2496.57，R2=0.9969。肌苷和尿苷的浓度线性范围分别在2.04～13.60 ng·mL-1和15.72～104.80 ng·mL-1时，线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 精取肌苷和尿苷浓度分别为6.80 ng·mL-1和41.92 ng·mL-1的对照品溶液连续进样6次，肌苷和尿苷峰面积的RSD分别为2.73%和2.79%，精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取样品0.10 g，按“2.1.2”供试品溶液制备方法平行提取样品6份，按UFLC-MS-MS方法测定面积。结果尿苷的平均含量为1227.7 μg·g-1，肌苷的平均含量为72.94 μg·g-1，RSD分别为2.82%、3.45%。

2.3.4 检测限和定量限 取尿苷和肌苷对照品储备液逐级稀释，至信噪比(S/N)为3和10。此时尿苷的检测限为1.05 ng·mL-1，定量限为4.51 ng·mL-1；肌苷的检测限为0.47 ng·mL-1，定量限为1.36 ng·mL-1。

2.3.5 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0、2、4、8 h进样测定，尿苷和肌苷峰面积RSD分别为1.63%，1.49%。结果供试品溶液在8 h内稳定。

2.3.6 回收率试验 取6份已测含量的蝉花，分别精密加入尿苷和肌苷对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积计算回收率。结果尿苷和肌苷的平均回收率分别为91.72%，90.58%，RSD为2.42%、3.70%，表明该试验方法可靠。见表2。

表2 回收率试验

2.4 样品测定 取6批蝉花粉末0.1 g(过四号筛)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，根据回归方程计算供试样品的含量。结果见表3。

表3 6批样品含量测定 (n=3)

3 讨论

本实验对提取方法进行考察，考察溶剂(水、50%甲醇、甲醇)，提取时间(10 min、30 min、60 min)结果选用溶剂水超声提取30 min，具有操作简单、含量提取充分。

比较不同的流动相组成(甲醇-水、0.1%甲酸水-甲醇、乙腈-水)，实验结果显示以甲醇-水为流动相洗脱时，分离时间短，峰形对称，检测灵敏度高。

本实验测定方法经各项考察,结果表明方法简便、结果准确，重现性好，能同时测定2种核苷类物质，可为准确测定蝉花中更多核苷类有效成分提供基础。