江西3个地理群体野生鲫肌间骨的比较分析

李福贵 ，程林慧，韩雨晴，张士林，何 坤，孙艺文，吴华东，刘凯月，段晓迪，董传举*

（1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045；2.河南师范大学水产学院，河南新乡 453007）

【研究意义】肌间骨（intramuscular bone，IB），又名肌间刺或肌间小骨，分布于椎骨两侧肌间隔中，是由肌膈结缔组织中的间充质细胞不经过软骨阶段直接骨化而成的膜性硬骨，是硬骨鱼类特有的结构之一[1-3]。根据其附着位置分为髓弓小骨（epineuria bone）、脉弓小骨（epipleural bone）和椎体小骨（epicentra⁃lia bone）3类[1]。肌间骨是鱼肉肌肉品质的一个重要指标，不同鱼类肌间骨的数量、性状和分布特征差异显著，在很大程度上影响其经济价值。因此，选育肌间骨数量少、形态简单的品种具有重要的生产意义与经济价值。【前人研究进展】迄今对肌间骨的研究报道主要集中在几个方面：不同鱼类肌间骨解剖和形态学分析[4-5]，肌间骨发育与骨化模式分析[6-13]，肌间骨形成调控基因或microRNA 鉴定与功能验证[14-21]，通过杂交、雌核发育等多种育种手段选育肌间骨少的鱼类新品系等[22-26]。研究表明，年龄、游泳方式、进化地位、遗传倍性等均对鱼类肌间骨的数量、形态与分布有显著的影响[1-2,5,22,26-27]。肌间骨的数量、形态与分布不仅可以作为鱼类分类形态学指标，同时也是经济鱼类食用品质的重要性状。【本研究切入点】鲫（Carassius auratus），隶属于鲤科（Cyprinidae），鲫属（Carassius），是我国常见的大宗淡水鱼类之一，具有繁殖力强、抗病抗逆能力强、肉质鲜美等优点，深受消费者的欢迎[28-31]。随着系列优良品种的推广，2018 年全国鲫总产量达277 万余吨[31]。然而，在常见的大宗淡水鱼类品种中，鲫的肌间骨数量及类型数量最多[30]。目前有学者对洞庭水系二倍体鲫（C.auratus）[26]、异育银鲫[4]及其选育品系（候选品种）[22]、淇河鲫（Carassius auratusvariety Qihe）[14]、彭泽鲫以及其他改良鲫鲤杂交品种（或品系）[26]的肌间骨的数量、形状和分布进行了比较研究，但尚未有不同地理群体鲫肌间骨的比较分析报道。【拟解决的关键问题】因此，本研究对江西萍乡（PX）、南昌（NC）、瑞昌（RC）3 个地理群体野生鲫肌间骨的数目、形态和分布进行了详细的观察和统计，以便为鲫肌间骨遗传改良提供形态学基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018—2019年在江西农业大学动物科学技术学院水产系实验室进行。3个野生鲫地理群体分别采自江西萍乡萍水河（PX，113.79°E，27.57°N，海拔85 m）、南昌赣江（NC，116.07°E，28.80°N，海拔17 m）、瑞昌长河（RC，115.67°E，29.65°N，海拔97 m），地理位置分布见图1。

图1 样品采集点信息Fig.1 Location information of sample collection

图2 3个鲫地理群体外形Fig.2 External morphology of crucian carps from 3 geographical populations

为排除个体大小对鲫肌间骨数量的影响，分别采集了体质量相近的个体进行分析。采用传统的方法进行试验鱼形态学测量，3个群体外形图见图2，样品数和规格参数见表1。

表1 3个鲫地理群体形态学测量Tab.1 Morphological measurement of crucian carps from 3 geographical populations

1.2 肌间骨的解剖与形态观察

肌间骨的解剖、形态观察以及分布参照Long 等[32]、李志等[22]和黎玲等[26]描述的方法进行。将活鱼麻醉后，擦干鱼体表水分后测量全长、体长、头长、体宽、体高、体质量、侧线鳞数等指标。用纱布将鱼包裹，于灭菌锅0.05～0.10 MPa 压力条件下蒸5 min 至九成熟。待鱼体降温后剥去纱布，于解剖盘中去除皮肤组织，小心剔除肌肉，从尾至头依次取出髓弓小骨和脉弓小骨，按其在鱼体中的位置整齐排列，用Canon EOS 70D相机拍照记录。

1.3 数据统计分析

实验数据采用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析，数据间比较用Duncan法进行。柱状图采用Sig⁃maplot12.0软件绘制，取P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 3个地理群体野生鲫总肌间骨数目比较分析

本研究对PX、NC与RC 3个地理群体鲫肌间骨进行了解剖观察，3个群体均有髓弓小骨和脉弓小骨，均无椎体小骨。对3个群体的左侧、右侧与总肌间骨数目进行了统计与比较，结果见表2。对3个群体的髓弓小骨与脉弓小骨数目进行了统计与比较，结果见表3。

表2 3个鲫地理群体肌间骨数目Tab.2 Intermuscular bone numbers of crucian carps from 3 geographical populations

表2 结果表明：PX、NC 与RC 3 个群体总肌间骨数目分别为（80.00±3.08），（79.83±8.06）和（83.25±4.99），两两之间均无显著性差异（P＞0.05）；PX、NC 与RC 3 个群体右侧肌间骨数目分别为（39.60±1.82）、（40.83±6.55）和（41.50±4.04），两两之间均无显著性差异（P＞0.05）；PX、NC 与RC 3 个群体左侧肌间骨数目分别为（40.40±2.61）、（39.00±1.55）和（41.75±0.96），PX 与RC 间无显著性差异（P＞0.05），但均显著大于NC群体（P＜0.05）。

表3 3个鲫地理群体髓弓小骨与脉弓小骨数目Tab.3 Epineural bone and epipleural bone numbers of crucian carps from 3 geographical populations

表3 结果表明：PX、NC 与RC 3 个群体的髓弓小骨数分别为（54.80±2.39）、（54.80±6.85）和（54.00±3.37），两两之间差异均不显著（P＞0.05）；PX、NC 与RC 3 个群体的髓弓小骨数分别为（25.20±3.90）、（25.17±2.32）和（29.25±4.11），两两之间差异均不显著（P＞0.05）。

2.2 3个地理群体鲫肌间骨形态与数量统计分析

通过解剖观察，3 个群体的肌间骨分为“I”形、“）”、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、两端两分叉形、树枝形和两端多叉形等8 种类型（图3 和表4）。与已报道的其他鲤科鱼类相比[4]，“）”是特有的肌间骨形态。PX、RC 群体均包含7 种类型，而NC 群体包含8 种类型，即多了“两端多叉型”，且数量较多（图3 和表4），呈现了更加复杂的肌间骨形态特征。

由表4 可知，3 个群体所含“I”与“）”形肌间骨数占比为40%左右，而由此分化的更加复杂的“卜”与“Y”形肌间骨数占比为50%左右，其他3种（4种）更加复杂的肌间骨数占比为10%左右。

图3 3个地理群体鲫肌间骨的比较Fig.3 Comparison of 7（or 8）various types of intermuscular bones among crucian carps from 3 geographical populations

表4 3个地理群体鲫不同形态肌间骨数目Tab.4 Number of intermuscular bones in Crucian carps from 3 geographic populations

由图4可知，“I”形、“卜”形、“Y”形、“一端多叉”形等4种类型肌间骨数在PX、NC与RC 3个群体中均没有显著性差异（P＞0.05）；NC 群体“）”形肌间骨极显著少于PX 与RC 群体（P＜0.01），两端两分叉形肌间骨数量显著高于RC（P＜0.05）、极显著高于PX群体（P＜0.01），树枝形肌间骨与PX无显著差异且两者均显著低于RC群体（P＜0.05），两端多分叉形肌间骨极显著高于PX与RC群体（P＞0.01）。

图4 3个地理群体鲫不同肌间骨的平均数目Fig.4 The average number of intermuscular bones in crucian carps from 3 geographical populations

2.3 3个地理群体鲫不同形态肌间骨分布差异分析

参照其他鲤科鱼类肌间骨研究方法，笔者从尾部向头部逐步解剖，并依次记录肌间骨的形态、数量及分布位置。肌间骨分布从尾部往头部方向1-9 体节划定为尾部，从第10 体节至27 体节为躯干部，脊椎往背部方向为轴上部，脊椎往腹部方向为轴下部（图5）。3 个地理群体鲫不同形态肌间骨分布差异性分析结果见表5。

图5 3个地理群体鲫肌间骨的形态与分布Fig.5 Morphology and distribution of intermuscular bone in crucian carps from 3 geographical populations

表5 3个地理群体鲫不同形态肌间骨分布差异性分析Tab.5 Difference analysis of intermuscular bones distribution in crucian carps from 3 geographic populations

图5 与表5 可知：PX、NC 与RC 3 个地理群体鲫左侧、右侧上的躯轴上肌间骨总数均大于躯轴下肌间骨数，尾轴上、下肌间骨数目差异不大；PX、NC 与RC 3 个群体左侧、右侧的躯轴上肌间骨数目均显著大于尾轴上肌间骨数目（P＜0.05或P＜0.01），躯轴下肌间骨数均低于尾轴下肌间骨数目。不同形态肌间骨在PX、NC、RC 3个群体中分布特征比较显示：“I”形在左右躯轴上、下部以及左右尾轴上的分布数量均无显著差异（P＞0.05），但在PX 左尾轴下的分布数量显著低于NC、RC（P＜0.05），在RC右尾轴下的分布数量显著低于PX、NC；“）”形在NC躯轴与尾轴上、下部分布数量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；“卜”形在NC 躯轴上下部与尾轴上下部分布数量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；“Y”形在NC 躯轴上部分布数量均低于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01），在NC 尾轴上、下部分布数量均显著高于PX、RC（P＜0.05 或P＜0.01）；两端两分叉形在NC 躯轴上部分布数量显著高于PX、RC（P＜0.05或P＜0.01）；树枝形在PX左尾下部分布数量显著低于NC、RC（P＜0.05）；两端两多叉形仅在NC群体中有分布，左右侧分布数量无显著差异，在尾轴上、下部分布数量上无显著差异，但都显著低于躯轴上、下的分布数量。NC躯轴下几乎无肌间骨分布，而PX、RC两个群体躯轴下均有“）”形、“卜”形肌间骨。上述结果表明，PX、RC群体躯干部分肌间骨分布数量均高于NC，而尾部肌间骨分布数量均低于NC。

3 讨论

绝大部分鲤科鱼类具有较复杂的肌间骨且肌肉疏松[4]。因此，有学者认为肌间骨的主要作用可能是肌节间的力量传导[32-34]，即在肌肉收缩时限制肌节的变形[35-36]。然而，蛋白质含量较高的鱼类，如鲑形目或鲈形目鱼类，肌肉中很少或没有肌间骨[1-2,5]，因为其可依靠肌纤维进行肌肉力量传导，较少或不需要借助肌间骨进行力量传递[1]。李志等[22]推测鱼类肌肉中蛋白质含量与肌间骨的数量相关，但目前仍缺乏直接的实验证据。鉴于肌间骨对鲜鱼食用及深加工的不利影响，掌握鱼类肌间骨分布特征，并在此基础上通过有效的育种方法进行遗传改良，最终获得更少或没有肌间骨的品种，进而可为人类提供更高品质肉类产品。

本文发现PX、NC与RC 3个群体野生鲫肌间骨分布特征均与已报道[4]的鲤科鱼类相似，表明3个群体肌间骨分布与进化时空与其他鲤科鱼类处于相近阶段。总肌间骨数目、右侧肌间骨数目在PX、NC与RC 3个群体中两两之间均无显著性差异（P＞0.05），左侧肌间骨数目PX与RC群体间无显著性差异（P＞0.05），但均显著大于NC群体（P＜0.05），表明部分鲫的肌间骨并非呈左右对称分布且不同群体之间会发生变化，这种现象在其它鲤科鱼类中同样存在[4-5,9,37]，但与国内早期学者的研究不一致[38]，导致此现象的原因尚无明确的定论，但研究报道表明不同鱼类的体型、生态习性、游泳速度等均对其肌间骨数量有重要影响[9,27,39]。

通过肌间骨形态分析发现，3个群体的肌间骨共有“I”形、“）”、“卜”形、“Y”形、一端多叉形、两端两分叉形、树枝形和两端多叉形8 种类型。与已报道的其他鲤科鱼类相比[4]，“）”是特有的肌间骨形态，与聂春红等[25]报道的团头鲂特有的“（”肌间骨一致。PX、RC 群体均包含7 种类型，而NC 群体包含8 种类型，即多了“两端多叉型”，且数量较多（图3 和表4），表明NC 群体的肌间骨形态特征更加复杂。图3 和表4结果表明，PX、RC群体躯干部分肌间骨分布数量均高于NC，而尾部肌间骨分布数量均低于NC。考虑3个群体所处河流的水流速度对肌间骨数量的影响，本研究中PX 取样地萍水河是湘江第一支流，流域面积达584.7 km2，径流量年均值18.3 m³/s，平均流速约为0.25 m/s（2016 年政府环评报告）；NC 取样地赣江南昌段流域面积达83 500 km2，年径流量约2 130 m³/s，年均流速约为3.3 m/s；RC 取样地为江西赛湖上游段，平均水深2 m，汛期时可达10 m，水域相对封闭，流速可以忽略不计。因此，推测栖息地水流速大是导致NC 群体尾部肌间骨数量更多且更复杂的原因。此结果进一步验证了Danos 和Staab[33]提出的机械力推动了真骨鱼类骨骼变异和进化的观点。

本研究观察到了3个群体鲫肌间骨数量及分布特征差异，但原因尚不明确。目前对于肌间骨形成的主要调控基因和作用机制的研究，具有一定进展，例如：Lü 等[40]研究发现MsxC（muscle segment homeobox C）基因可能对唇䱻肌间骨的形成有一定影响；Wan 等[20]研究表明团头鲂miRNA 可能对低等真骨鱼类肌间骨形成具有调控作用；张伟卓[16]研究表明团头鲂BMP 家族基因在其肌间骨发生发育中起到表达调控作用；陈宇龙等[17]研究表明团头鲂tnmd/xirp2a是其肌腱发育的重要相关基因；何苹萍等[18]发掘了与禾花鲤与建鲤肌间骨miRNAs；田雪等[14]、王良炎等[15]、杨敏璇等[30]研究揭示了SOST基因在淇河鲫/鲫肌间骨骨化过程中起到重要调控作用。尽管越来越多报道显示相关基因或miRNA的对肌间骨形成有重要的调控作用，但仍无法解析不同地理群体间肌间骨的差异形成原因。因此，笔者推测鱼类肌间骨的形成可能是由多基因或相关调控因子形成的复杂调控网络决定，同时环境因子（如水流速度）诱发的表观遗传变异共同构成了更加多样的差异。具体作用机制，仍需进一步研究。

鲫鱼味道鲜美、营养丰富，但肌间骨较多，鲜肉食用和深加工利用率差，因此迫切需要通过技术手段减少其肌间骨数目。目前，研究人员通过人工诱导雌核发育获得了一尾无肌间骨的草鱼突变体，且其体型、生长、脊椎骨和附肢骨发育均正常[41]；黎玲等[26]通过远缘杂交并结合人工雌核发育，并经多代选育获得的改良二倍体红鲫，以及改良四倍体鲫鲤与改良二倍体红鲫倍间杂交获得的改良三倍体鲫鲤“湘云鲫2 号”的总肌间骨数目均少于野生二倍体鲫和彭泽鲫；蒋文枰等[23]通过远缘杂交获得的鲌鲂F1和F2肌间骨数目减少，均表现出比母本翘嘴鲌有利于食用与深加工的优势，鲌鲂F2的总肌间骨数目略低于鲌鲂F1，但每一肌节平均肌间骨数目显著低于鲌鲂F1；李志等[22]利用团头鲂精子与银鲫E 系卵子受精后辅以冷休克处理，获得后代经多代雌核雌核发育得到异育银鲫F 系，其6 月龄和18 月龄银鲫F 系躯个体体轴上肌节间的复杂“Y”形髓弓小骨数目均比相应月龄的银鲫A+系少，而简单的“I”形髓弓小骨数目比相应月龄的A+系多，表现出一种有利于食用的优势。这些结果表明，通过远缘杂交可以获得肌间骨较少的优良品种。因此，鉴于不同地理群体鲫间肌间骨数量及形态特征存在差异，通过采集亲缘关系较远的鲫地理群体为亲本，结合人工雌核发育与杂交，可能有助于获得肌间骨较少的鲫新品种。