MicroRNA参与水生动物环境污染物胁迫应答的 研究进展

王梦婷 曹杰宇 王忠新 王雅瑜 杨大佐 周一兵 赵欢

（1. 大连海洋大学 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，大连 116023；2. 大连海洋大学 农业农村部北方海水增养殖重点 实验室，大连 116023）

Micro RNA（miRNA）是一类长度约为18-24个核苷酸的非编码内源RNA［1］，1993年在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中首次发现miRNA（lin-4），目前在植物、动物、细菌和部分病毒中都发现miRNA的存在。动物miRNA的合成包括初级转录本miRNA，前体miRNA到成熟miRNA三个阶段。细胞核内编码miRNA的基因通过RNA聚合酶II转录形成初级转录本miRNA，即pri-miRNA，pri-miRNA包含5′端帽子和3′端多聚腺苷酸尾巴结构。pri-miRNA随即在核糖核酸酶RNase III（double- strand specific ribonuclease，Drosha） 作 用 下 形成60-70个碱基的发卡状结构前体miRNA（premiRNA）［2］。pre-miRNA 随后被转运蛋白Exportin-5从细胞核中转运至细胞质［3］，经Dicer剪切成为双链复合体结构［4］。双链复合体解链形成成熟的miRNA，成熟的单链miRNA与RNA诱导的沉默复合物RISC（RNA-induced silencing complex）结合而发挥作用。虽然miRNA序列较短，但是已有研究发现其在基因表达中起到重要作用。miRNA与特异性的靶目标mRNA进行不完全互补配对，通过诱导靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻译等方式对基因表达进行调控［5-6］。已有报道表明miRNA参与动物细胞发育［7］、分化［8］、增殖和凋亡［9］、免疫［10］、脂肪代谢［11］等多种生命活动。

水生生物生活离不开水，水环境的改变会对水生生物机体稳态产生影响，重金属、有机污染物等问题已严重影响水生生物的生存及水生生态系统的稳定。越来越多的证据表明 miRNA在水生生物外源环境因子胁迫应答中发挥着不可或缺的作用，如在重金属或有机污染物等污染胁迫下，miRNA通过调控细胞发育或凋亡、机体解毒代谢及改变机体耐受性等过程，参与机体对污染物的毒性响应。本文对在不同类型环境污染物胁迫下，水生生物体内miRNA参与调控的机制进行综述，以期为后续系统开展miRNA参与水生动物抗逆性方面的研究奠定一定的理论基础。

1 环境污染物胁迫下miRNA的响应机制

1.1 重金属胁迫下miRNA的响应机制

重金属在环境中普遍存在，可通过呼吸、体表渗透、摄食等方式进入水生动物体内，但重金属在动物体内不易降解，因此会长期蓄积在动物体内，进而引起细胞凋亡，影响机体生长发育［12］。不同种类的水生动物对重金属的耐受性存在差异，在无脊椎动物贝类和节肢动物中发现miRNA参与机体对重金属的耐受性。Bao等［13］将泥蚶（Tegillarca granosa）暴露于250 μg/L镉24 h后发现，泥蚶血淋巴中16个miRNAs出现了差异表达，其中TgrnmiR-21表达量出现明显下调，并调控阳离子扩散促进子（cation transport and diffusion facilitators，CDF）相关蛋白，进而改变生物体内金属稳态性和耐受性。Chen等［14］发现暴露于20 μg/L镉中48 h会引起淡水枝角水蚤（Daphnia pulex）体内21个miRNAs表达发生改变，miR-71和miR-210出现明显上调，靶向调控SCN2A、SLC31A1基因，进而参与机体的离子运输，其中miR-71是Ca2+信号抑制剂，其表达量的上调会抑制Ca2+的信号传导，进而改变镉诱导下淡水枝角水蚤的离子稳态。Chen等［15］进一步发现将淡水枝角水蚤（D. pulex）暴露于10 μg/L镉繁育25代后进行净化，净化的子二代和子三代淡水枝角水蚤体内miR-33、miR-252表达下调，预测miR-33、miR-252可能通过调控GTPase通路，抑制细胞生长和增殖，进而达到增加机体镉耐受性的目的。

miRNA除了可以改变水生动物重金属耐受性，还会通过调控水生动物的免疫应激和解毒代谢参与机体对重金属的毒性效应，已有报道表明镉可引起鱼体内参与应激调控的相关miRNA表达发生变化，进而影响下游基因的表达。Liu等［16］将锦鲤（Cyprinus carpio）暴露于0.275 mg/L镉中30 d，结果发现鱼体前肾中miR-122、novel-miR6、miR-193a-3p表达显著下调，而miR-27a-5p表达显著上调，靶向 上 调BAX、BAD、BAK、CASPASE9和 PIDD基因，其中miR-122和miR-193a-3p参与机体抗炎和抗肿瘤过程，而miR-27a-5p则会抑制炎症反应，这些miRNAs的变化表明镉胁迫可能会引起锦鲤前肾细胞凋亡。Qiang等［17］发现暴露于12 mg/L镉的罗非鱼（Oreochroms mossambcus）体内miR-122表达明显下调，其通过与MT3′UTR结合，降低荧光素酶活性，促进机体金属硫蛋白（metallothionein，MT）的表达，证实miR-122在罗非鱼应激反应的调节中也起重要作用。重金属胁迫下，miRNA的差异表达在甲壳类和贝类也有相关报道。Guo等［18］将凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）暴露于5 mg/L铜中发现，miR-1175a-3p、novel-miR-46、miR-228、novel-miR-8及其调控的靶向基因（机体免疫反应、细胞凋亡及外源物质代谢相关基因如细胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）、凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）等）表达出现显著变化，表明miRNAs可能参与凡纳滨对虾抵御重金属胁迫的调控。张晶晶等［19］将中国蛤蜊（Mactra chinensis）暴露于2.76 mg/L镉中48 h，发 现miR-2202-5p、miR-963-3p和miR-216c-3p表达显著上调发现，蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）活性下降，通过介导AMP-激活蛋白激酶α（AMPKα）的去磷酸化来调控热休 克 蛋 白（heat shock proteins，HSP）中HSP70和HSP27的表达并参与细胞应激反应，预测这些miRNAs可能参与重金属胁迫下机体的免疫调节。以上研究结果表明，miRNA可以作为重金属对水生动物毒性效应的分子标记，调控解毒代谢及免疫调节相关靶基因，进而引起机体反应。

1.2 有机污染物 胁迫下miRNA的响应机制

除重金属以外，有机物也是一类广泛存在于水生环境中的污染物，已有大量研究表明有机污染物暴露会影响水生生物个体发育、性腺分化等多个生理生化过程，miRNA可参与有机污染物胁迫下水生生物体内生理活动的调控。目前在模式生物斑马鱼（Danio rerio）胚胎中已开展部分研究，发现miRNA可调控有机污染物胁迫下斑马鱼胚胎心脏发育。王菊等［20］发现暴露于10 mmol/L丙烯酰胺（acrylamide，ACR）的斑马鱼胚胎体内miR-21表达上调，miR-21靶向调控心脏形成关键调节因子Hand2基因的表达，进而可能影响斑马鱼心脏细胞的生长和分化过程。Wu等［21］发现暴露于六溴环十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD）的斑马鱼胚胎体内miR-1表达下调进而抑制nkx2.5基因表达，预测miR-1参与六溴环十二烷暴露下斑马鱼心脏发育的调控。Jenny等［22］将斑马鱼胚胎暴露于5 nmol/L的2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）60 hpf后发现，miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-27e和miR-451表达发生改变，调控AHR通路，其中miR-23a和miR-24的上调可能与TCDD引起斑马鱼心脏发育畸形相关。miRNA不仅可对有机污染物胁迫下斑马鱼胚胎心脏发育进行相关调控，也可影响骨骼、神经系统发育。Ju等［23］发现多氯联苯（polychlorinated biphenyl，PCB）（PCB1254）暴露下斑马鱼胚胎体内miR-21表达上调，抑制骨形态发生蛋白受体Ⅱ（bone morphology protein receptor II，BMPRII）表达，影响斑马鱼胚胎骨骼发育。Zhang等［24］将受精后6 hpf 至120 hpf的斑马鱼胚胎暴露于10 mg/mL全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulphonate，PFOS）中发现，PFOS会引起20个miRNAs表达出现上调，19个miRNAs表达下调，预测其中表达上调的miR-19b-c可靶向调控如Cdk5、smad1、sox11b和pou5f1等多种基因，进而调控神经系统发育。也有研究表明miRNA在有机污染物胁迫下斑马鱼的细胞凋亡和信号传导的改变中也起重要作用。

miRNA不仅参与有机污染物胁迫下斑马鱼胚胎发育的调节，在有机污染物对斑马鱼免疫毒性效应中也具有一定的调控作用，可以调控斑马鱼的免疫防御及细胞凋亡过程。Huang等［25］和Zhou等［26］发现暴露于氟虫腈的成年斑马鱼体内miR-155，miR-216b和miR-499表达下调进而调控cyb561d2基因表达上调，预测其参与氟虫腈胁迫下斑马鱼体内的免疫调节。Wang等［27］发现成年斑马鱼单独和联合暴露于30%三唑磷（triazophos）和1%氟虫腈（fipronil）96 h，体内miRNAs表达存在差异。三唑磷暴露下，鱼体内miR-21、miR-31、miR-203b和miR-455表达上调，miR-135c、miR-30b和miR-365表达下调；氟虫腈暴露下，鱼体内miR-199、miR-22b和miR-499表达下调；联合暴露下，鱼体内miR-735表达上调，miR-128、miR-9表达下调，其中miR-181a是唯一一个在两种污染物中均出现表达上调，预测其可通过靶向 BCL-2、CD69基因，进而调控机体免疫反应。Jia等［28］发现成年斑马鱼暴露于不同浓度三唑磷中体内miR-217表达出现下调，其调控的靶基因nup43表达上调，进而调控细胞凋亡。

部分有机污染物（如双酚A，双酚S等）属于环境内分泌干扰物，可以影响生物激素代谢，进而产生生殖毒性效应。在模式生物斑马鱼中已发现miRNA参与生物对有机污染物对生殖毒性响应。Renaud 等［29］对0.125 nmol/L的双酚A（bisphenolA，BPA）暴露下斑马鱼肝脏组织中miRNA表达进行分析 发 现，14个miRNAs（miR-725、miR-724、miR-499-3p、miR-458、miR-430c、miR-430a、miR-430b、miR-499-5p、miR-205、miR-202、miR-193a、miR-184、miR-133a和miR-122）表达上调，1个miRNAs（miR-2189）表达下调，这些miRNAs可能靶向上调insrb、eif2ak3、traf2a基因，并参与机体生殖及激素代谢调控。Lee等［30］将雄性斑马鱼暴露于5 μg/L和50 μg/L双酚S（bisphenol S）21 d，结果发现 性腺中dre-miR-30c、miR-192、miR-430a、miR-430b、 miR-454和miR-499表达下调，这些miRNA靶向上调参与激素转化的cyp19a1基因表达。miR-430是机体生殖调控的重要调节，以斑马鱼nanos1的3′UTR 作为靶点，诱导体细胞的mRNA的凋亡、降解，进而调控激素代谢。脊椎动物中除斑马鱼外，部分学者亦研究了多环芳烃暴露下稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）［31］和 文 昌 鱼（Branchiostoma belcheri）［32］中miRNAs的表达变化，以及阿特拉津和来曲唑（Letrozone，LET）暴露下黄河鲤（Cyprinus carpio）幼鱼性腺miRNA靶基因表达变化发现［33］，这些鱼体中 miRNAs也参与机体解毒代谢和性腺分化相关调控。以上可以看出有机污染物胁迫下，miRNA参与鱼类发育、代谢等多方面的调控，但目前关于miRNA参与调控有机污染物对水生动物的研究集中于脊索动物门，在无脊椎动物中相关研究尚未见报道。

1.3 新型污染物胁迫下miRNA的响应机制

随着纳米材料（nanoparticles，NPs）在医药、化妆品、能源等领域的使用，纳米产品的使用日益广泛，据估计截止到2019年，全球纳米产品的消费量达到5.8×105t［34］。纳米材料在生产和使用过程中会释放入环境，对环境产生潜在危害。目前在斑马鱼中证实miRNA参与调控纳米材料对水生生物的毒性效应。Hu等［35］将斑马鱼暴露于硅纳米粒子（silica nanoparticles，SiNPs）发现，miR-223负向调节中性粒细胞分化，进而可能参与炎症的调节过程。Hu等［36］发现硅纳米颗粒和甲基汞（MeHg）联合暴露下，斑马鱼miR-375和miR-206表达量增加，miR-7147和 miR-26a表达量降低，通过调控stxbp1a、celf4、ahr1b、bai2基因，参与调节心脏肌肉收缩，进而影响心血管系统。

药品及个人护理品（pharmaceutical and personal care products，PPCPs）包括各类处方药和非处方药（如抗生素、抗癫痫药和抗抑郁药等）、化妆品、香料等，PPCPs与人类的生活密不可分，所以在环境中普遍存在。近年来越来越多的研究发现PPCPs进入环境会对生物产生毒性效应，而miRNA也参与PPCPs对生物体的毒性效应调控。Martinez等［37］将斑马鱼分别暴露于54 μg/L氟西汀5个月和9个月后进行繁殖，结果发现，5个月时，斑马鱼卵中miR-25、miR-26、miR-30d、miR-92a、miR-103表达上调，miR-740表达下调；9个月时，斑马鱼卵中miRNA-30d 和 miRNA-92a 表达量增加。其中miR-25、miR-740可分别靶向上调fkbp5、pomcb，预测发现这些miRNAs可能参与调控机体应激反应。

PPCPs胁迫下，miRNA可主要影响斑马鱼体内代谢反应，Lin等［38］将斑马鱼暴露于不同浓度三氯生（Triclosan，TCS）中，发现miR-125b、miR-205、miR142a和miR-203a 表达上调，证实pri-mir-125b1和 pri-mir-125b-3参与了Nfe2l2 的调控，进一步预测miRNA可通过靶向调控影响脂肪酸合成及代谢。Wang等［39］发现暴露于β-二酮类抗生素（β-Diketone antibiotics，DKAs）中斑马鱼体内miR-125b、miR-144表达上调，抑制ppardb、bcl2a、pparaa、pparda基因表达，进而可能影响机体脂肪代谢反应。Craig等［40］对暴露于540 ng/L氟西汀（fluoxetine，FLX）的斑马鱼体内miRNAs进行表达分析发现，drelet-7d和dre-miR-140-5p表达上调，预测其可以通过调节单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）α1和α2，进而影响肝脏代谢。

miRNA也参与PPCPs暴露下斑马鱼神经发育的毒性响应。Liu等［41］将斑马鱼暴露于不同浓度三氯生中，发现体内miR-137表达量显著增加，但其靶向基因（bcl11aa、MAPK6、Runx1）表达量降低，通过调控MAPK 信号通路，影响斑马鱼的神经发育。Aluru等［42］对暴露于不同浓度丙戊酸（Valproic acid，VPA）中的斑马鱼胚胎体内miRNAs表达分析发现，暴露48 hpf时，4个miRNAs（miR-16a、18c、22a和457b）表达上调，9个miRNAs（miR-96、122、124、132、135a、140、182、182*和724）表达下调；暴露96 hpf时，11个miRNAs（miR-10b、10c、16a、16b、18c、22b、210*、217、451、455和457b）表达上调，11个miRNAs（miR-21、27c、29a、29b、34、122、132、192、194a、212和724）表达下调。96 hpf时，这些miRNAs抑制靶基因bdnf、ncor2和 mmp9的表达，通过靶基因预测发现部分上调表达 miRNAs 参与癌症和细胞循环通路，而下调表达的 miRNAs 参与了 MAPK 激酶信号传导，进而影响斑马鱼的神经发育。此外，Li等［43］用微量β-双酮类抗生素（β-diketone antibiotics，DKAs）胁迫斑马鱼，发现miR-184表达下调，而miR-10c和miR-92a 表达下调，预测miR-92a可靶向slc2a3基因，进而导致心脏缺陷。

另外，Duan等［44］发现斑马鱼暴露于颗粒物（particulate matter，PM）PM2.5中，miR-7a、miR-7ab和miR-19b-3p 出现表达下调，通过调控cyp3a65、mgst2、gstp1、gsto2、aldh3b1和ephx1等基因，进而可能对心肌细胞起保护作用，并抑制心肌纤维形成，调节免疫反应。但与有机污染物相类似，目前关于新型污染物暴露下水生动物miRNA调控的研究也是主要集中于斑马鱼，其他水生脊椎动物及无脊椎动物相关报道尚未见报道。

2 存在问题及展望

通过以上研究可以发现，外源污染物暴露会引起水生动物体内miRNA表达发生变化，miRNA可以通过调控细胞生长发育、机体代谢、免疫应激等多种过程，参与机体对外源污染物的毒性响应。但是，由于水生动物基因组研究相对缓慢，miRNA和靶基因之间调控功能的研究更多集中在模式生物斑马鱼，而其它水生脊椎动物及无脊椎动物中研究主要集中在miRNA数量的确认和功能的预测，并且由于背景信息的缺失，通过高通量测序获得的许多miRNA处于未知状态，随着转录组学及基因组学的广泛应用，miRNA在水生动物抗逆性调控的机制将不断深入。

miRNA参与生物毒性效应表明miRNA在生物抗逆性中的重要性，研究发现，miRNA具备多重靶向性，一个miRNA可以同时靶向调控多个基因，一个基因也可被多个miRNA调控，miRNA的多靶向特征使其拥有巨大的调节潜力。例如，miR-125在不同污染物胁迫下，分别靶向调控Nfe2l2以及ppardb、bcl2a、pparaa、pparda基因，参与调控脂肪代谢反应，进而证实一个miRNA可以靶向调控多个基因。此外，王菊等［20］的研究发现miR-21表达的变化与斑马鱼心脏形成关键调节因子Hand2基因的表达相关，参与斑马鱼心脏细胞的生长和分化过程，而Ju等［23］的结果表明多氯联苯PCB1254暴露下斑马鱼胚胎中miR-21表达上调可能与骨形态发生蛋白受体基因表达相关，影响斑马鱼骨骼的发育。Beate等［45］发现miR-21在鳉鱼中可负反馈调节igfbp3和 fosl1等下游基因，进而在肾脏中起增殖、凋亡作用。可以发现在不同生物中，同一miRNA调控功能不同，有关miRNA上游调控因子的鉴定和相关实验的验证仍需深入开展，进而深入阐明miRNA如何通过同一下游因子进而调控不同的生物学过程的分子机制。miRNA在具有多功能性的同时，也具有一定的保守性，在脊椎动物、无脊椎动物中均有已知的保守miRNA，如miR-21，不仅存在于斑马鱼等高等脊椎动物中，在泥蚶中也有报道［13］，但这些保守miRNA在不同物种间是否存在相同功能，尚未研究明确，还属未知。在以后的研究中，可以对同一miRNA是否在不同物种中具有相同调控功能，进行更深入的研究。

随着高通量测序技术的提高以及miRNA 研究方法的不断改进，利用不同研究手段去发掘水生动物miRNAs，并清晰阐述不同水生动物体内miRNA的种类及其在外源污染物暴露下的作用机理与调控途径将会为深入了解水生生物的抗逆性提供重要的理论依据。