大蒜素对卵巢癌细胞侵袭转移的抑制作用及机制

万慧芳，梁笑倾，刘卓琦,杨晓红,张霞丽，李 华，万福生*

(南昌大学a.医学实验教学中心；b.第四附属医院妇产科；c.基础医学院生物化学与分子生物学教研室;d.实验动物科学中心，江西 南昌 330006)

卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，病死率居妇科恶性肿瘤的首位[1-2]。卵巢癌早期症状隐匿，患者就诊时通常有60%～70%的人处于晚期[3]。尽管经过初次手术和化疗可达到完全缓解，但多数晚期患者仍会在2～3年后复发，甚至出现化疗耐药而死亡[4]。因此，寻找高效低毒的分子靶向药物，以提高疗效，减少卵巢癌死亡率是全世界亟待解决的重大问题。

大蒜素(diallyl trisulfide，DT)是百合科葱属草本植物的地下鳞茎大蒜中的主要有效成分，化学名为二烯丙基三硫化物，其结构式为CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2。近年来研究发现，大蒜素具有活血化瘀、益气解毒、宣通温补之功效[5]，其抗肿瘤作用在基础研究和临床试验中逐渐被证实，已作为多种癌症的辅助治疗药物投入临床使用，在妇科恶性肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。大量研究表明[5-9]，大蒜素对卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病等肿瘤生长有明显抑制作用，且还能增强机体的免疫力[8]，但它对卵巢癌侵袭转移的影响则少有研究报道。本文以人卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2细胞为研究对象，观察了大蒜素对卵巢癌细胞上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和侵袭转移的影响及其分子机制，旨在为大蒜素用于卵巢癌的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人卵巢癌细胞SKOV-3和ES-2细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、细胞裂解液均购自于Solarbio公司，GSK-3β单克隆抗体(Cat.Ab32391)，pho-GSK-3β(Ser9)单克隆抗体(Cat.ab75814)，E-cadherin单克隆抗体(Cat.Ab1416，Abcam公司)，Vimentin单克隆抗体(Cat.Ab92547),N-cadherin多克隆抗体(Cat.Ab18203),MMP2多克隆抗体(Cat.Ab37150),MMP7多克隆抗体(Cat.Ab5706),MMP9多克隆抗体(Cat.Ab38898),辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZB-2301)北京中杉金桥公司，大蒜素注射液(购自上海禾丰制药公司,批号:H31022371)，CCK8试剂(上海东仁化学科技有限公司)。

1.2 CCK8检测细胞增殖活性

在含10%胎牛血清的RPM I1640培养基中，用0.25%胰酶消化传代,37 ℃、5% CO2培养箱内常规传代培养,取对数生长期细胞用于实验。实验分组：空白对照组(control，不含DT)、DT 2.5，DT5.0，DT10.0和DT 20.0 μg·mL-1组。

取对数生长期细胞，胰酶消化制成密度约3×104个·mL-1单细胞悬液，以100 μL每孔接种于96孔板中，每组设3个复孔，共接种3块96孔板。经过夜贴壁后，弃去旧培养基，换成含不同溶度DT(0，2.5，5.0，10，20 μg·mL-1)的完全培养基，分别进行处理24，48，72 h。从第二天开始，在固定时间点，每隔12 h取1块96孔板，更换并加入100 μL新培养基(其中含有10 μL CCK8)，孵育3 h。在波长450 nm处测定其吸光度值。实验重复3次。

1.3 Transwell小室检测细胞迁移能力

将生长良好的细胞用不含血清的培养基饥饿处理12 h，用含0.25% EDTA的胰酶消化，完全培养基终止消化，无血清培养基制成单细胞悬液，调整密度为1×105个·mL-1。在Transwell小室的上室内加入200 μL上述细胞悬液，24孔板中的下室加入600 μL含不同浓度DT的10%血清的培养基，小室置于24孔板中，48 h后收小室。用棉签擦去上室细胞，PBS清洗3次后用4%细胞组织固定液固定细胞20 min，晾干后用1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤3次。小室干燥后在倒置显微镜下观察并使用图像采集系统选取上、中、下、左、右5个视野于100倍镜下进行拍照，计数并求其平均穿膜细胞数。实验重复3次。

1.4 Transwell小室检测细胞侵袭能力

先将Matrigel胶分别与不含血清的H-DMEM和RPMI-1640基础培养基按1:8的比例混合均匀(在冰上进行)。取该混合物60 μL铺于已预冷的小室中，将小室置于24孔板中，在37 ℃恒温培养箱中过夜凝固成胶状。然后接种细胞于小室中，接种于小室的细胞数为2×105个·孔-1，其余步骤与Transwell小室迁移实验一致，计算细胞侵袭能力。实验重复了3次。

1.5 Western blot检测卵巢癌细胞蛋白表达

收集经DT处理48 h的卵巢癌细胞，在冰上用RIPA细胞裂解液进行裂解，12 000 r·min-1离心(4 ℃)10 min，取上清液。采用PierceBCA ProteinAssayKit试剂盒检测蛋白浓度，按20 μg蛋白上样量将蛋白样品与上样缓冲液(5×)按4:1的体积比例混合，沸水中煮5 min使蛋白变性。冷却后，经10%SDS-PAGE并半干电泳转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入PTEN、AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、Vimentin、β-catenin等抗体，并4 ℃孵育过夜。次日，在室温下加二抗孵育2 h，ECL化学发光法显色，X线胶片曝光成像，扫描仪扫描蛋白条带。

1.6 统计学处理

结果用SPSS 20.0软件统计分析，组间进行单因素方差(one-way ANOVA)，假若方差齐性，则使用LSD(L)法进行两两比较，若方差不齐性时，使用Dunnett,s(T3)法分析，以P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 DT对卵巢癌细胞增殖的抑制作用

经不同浓度DT(0，2.5，5.0，10.0和20.0 μg·mL-1)分别处理卵巢癌SKOV-3细胞和ES-2细胞24，48和72 h。细胞增殖结果(见图1)显示，与control组比较，浓度为2.5～20.0 μg·mL-1的DT作用SKOV-3和ES-2细胞24，48和72 h后，对这两种细胞增殖均有不同程度的抑制作用(P<0.05)，且呈一定的量效关系和时效关系。

2.2 DT对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响

利用Transwell小室观察DT对SKOV-3和ES-2细胞侵袭与迁移的影响(见图2和图3)。结果显示，与control(对照组)组比较，DT处理48 h后，两种卵巢癌细胞的迁移和侵袭作用均随着DT浓度的增大而减小，穿膜细胞数量逐渐减少，DT对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的抑制率显著升高(P<0.05)。

2.3 DT对人卵巢癌细胞EMT和基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响

Western blot检测EMT相关因子和MMPs的表达变化，结果如图4和图5所示。DT处理SKOV-3和ES-2细胞48 h后，与control(对照组)组比较，随着DT浓度的增加，这两种细胞的E-cadherin表达均显著上调；相反，N-cadherin和Vimentin表达则呈现下降(图4)。同样，与control组比较，MMP2、MMP7和MMP9表达水平也随着DT浓度的增加而降低(图5)，这些结果表明DT可以阻碍SKOV-3和ES-2细胞EMT的进程和下调MMPs表达。

2.4 DT对人卵巢癌细胞中AKT/GSK-3β/β-catenin通路的影响

通过免疫印迹分析SKOV-3和ES-2细胞中PTEN、AKT、GSK-3β和β-catenin的蛋白水平(图6和图7)。结果显示，随着DT浓度增加，两种细胞的p-AKT，p-GSK-3β水平均逐渐呈显著性上调(P<0.05)，而AKT、GSK-3β则表现不同程度的降低(P<0.05)；且β-catenin表达水平也呈显著性下调(P<0.05)。此外，PTEN也有不同程度的升高(PTEN是AKT/GSK-3β/β-catenin通路上游信号分子)。此结果表明DT对AKT/GSK-3β/β-catenin通路有一定的调控作用。

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，绝大多数的卵巢癌是上皮性癌，尽管治疗方法在不断进步，但上皮性卵巢癌5年生存率也仅有30%。卵巢癌早期症状隐匿，60%～70%患者就诊时已处于晚期[10]。卵巢癌易侵袭转移也是卵巢癌患者生存期短、预后差的又一个重要原因。此外，癌细胞耐药性也是妇科肿瘤复发和预后差的又一个重要原因[11]。卵巢癌侵袭转移过程涉及到多种途径，近年来研究发现细胞自噬和微小RNA(microRNA，miRNA)与卵巢癌侵袭转移过程倍受关注[12-13]。因此，寻找高效低毒的分子靶向药物，提高卵巢癌化疗疗效、减少肿瘤细胞耐药、控制卵巢癌的侵袭转移，降低卵巢癌死亡率是全世界亟待解决的重大问题。近年来大量的研究提示大蒜素对于肿瘤细胞的生长、增殖、分化有一定的抑制作用[14-17]，已作为多种癌症辅助治疗的药物，在妇科及其他恶性肿瘤治疗中都具有广阔的应用前景。

我们实验室早期研究结果显示[9,18-19]：大蒜素对SKOV-3/DDP细胞有显著的抑制增殖和促进凋亡作用，增加SKOV-3/DDP细胞对顺铂的敏感性，其机制与大蒜素能调控PUMA、Bax、Bcl-2、Bcl-xl的表达和增强Caspase-3活性相关。并发现p53上调凋亡调控因子(PUMA)在大蒜素诱导人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株(SKOV-3/DDP)细胞凋亡中发挥关键性作用[19]。本文结果表明，DT对卵巢癌SKOV-3和ES-2细胞的侵袭迁移具有显著性抑制作用，且有一定的浓度依赖性(P<0.05)。同时发现DT能增加卵巢癌细胞中E-cadherin、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达，下调N-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白水平(图6和图7)，此结果提示DT对卵巢癌SKOV-3和ES-2细胞EMT过程有显著的抑制作用，其机制与AKT/GSK-3β/β-catenin通路相关，特别是GSK-3β在其中起重要作用。GSK-3β是一种由丝氨酸/苏氨酸组成的多功能激酶，在调节糖原代谢起关键作用，同时它又是PI3K/AKT信号通路下游基因，可磷酸化Snail转录因子调控EMT。GSK-3β是Wnt/β-catenin信号途径的关键因子，可以直接调控胞浆中β-catenin蛋白的稳定性。在Wnt经典信号中,E-cadherin可以与细胞内的β-catenin形成特殊地复合体,并直接连接到肌动蛋白细胞骨架上,从而保证上皮细胞的完整和功能发挥。而E-cadherin的缺失或下调是EMT发生过程中的重要标志之一。此外，本文结果还显示DT能下调卵巢癌细胞MMP2、MMP7和MMP9蛋白表达(见图5)，而基质金属蛋白酶(MMPs)能降解细胞外基质中多种蛋白质，破坏癌细胞侵袭的组织屏障，在肿瘤侵袭转移中起重要作用。Li等人[20]发现在肺癌中可通过GSK-3β/Snail/E-cadherin调控EMT，进而调节肺癌的侵袭转移；在乳腺癌和胃癌中也发现PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调控EMT[21-22]。本文结果表明，DT可通过调控AKT/GSK-3β/β-catenin通路抑制卵巢癌细胞EMT和侵袭转移，并希望AKT/GSK-3β/β-catenin通路将成为治疗卵巢癌的重要通路之一。