基于TCGA 和CGGA 数据库探究KIF15 在胶质瘤中的表达及临床意义

钟光华 郑守链 唐娉

胶质瘤是中枢神经系统最为常见的恶性脑肿瘤，患者预后极差。多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是胶质瘤中最恶性的病理类型[1-3]。患者在接受最大安全的手术切除、大剂量放射治疗和标准化学治疗后，总体中位总生存率仍然较短[4]。导致GBM 患者治疗效果不理想的一个重要因素是，肿瘤内部细胞异质性以及胶质瘤肿瘤干细胞的存在，导致了肿瘤细胞内部存在耐受现有的免疫治疗和分子靶向治疗[5-7]。因此，发现新的生物标志物有助于肿瘤精准治疗的发展。驱动蛋白家族成员15（Kinesin Family Member 15，KIF15）是一种蛋白质编码基因，编码的蛋白与21q22.11q22.12 微缺失综合征和乳腺癌的发病有关[8-9]。目前，国内关于KIF15 在胶质瘤中的表达特征及临床意义的研究报道罕见。本研究通过挖掘美国癌症基因图谱计划（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和中国脑胶质瘤基因图谱计划（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）胶质瘤患者的肿瘤样本的全转录组数据，结合相关基因和蛋白表达数据库，初步探讨了KIF15 在胶质瘤中的表达特征及临床意义，现报道如下。

资料与方法

一、数据库

人类基因蛋白表达库数据（https://www.proteinatlas.org/）用于分析KIF15 在人体器官组织中的表达特征。TCGA 和CGGA 基因全转录组数据（mRNAseq） 用于分析KIF15 在各级别胶质瘤中的表达差异。

二、胶质瘤芯片及免疫组织化学染色

包含94 例胶质瘤样本（含WHO 标准下Ⅱ～Ⅳ级，其中Ⅱ级24 例，Ⅲ级31 例，Ⅳ级39）的肿瘤组织芯片（武汉谷歌生物科技有限公司）用于KIF15的免疫组织化学染色。染色方法：组织芯片经二甲苯脱蜡、乙醇脱水后，用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，3%H2O2溶液去除内源性过氧化物酶活性。KIF15抗体（1∶400，ab251836，Abcam 公司，美国）用于一抗孵育（4℃冰箱中孵育16 h）。Polink-2 plus 聚合物HRP 检测系统 （北京中杉金桥生物技术有限公司）检测抗体。KIF15 的染色强度评分采用Image-Pro Plus 软件进行评估。评分标准为：未见染色为0 分，阳性细胞＜10%为1 分，阳性细胞在10%～70%为2分，阳性细胞＞70%为3 分。

三、转录组的生信分析

将TCGA 的转录组数据样本根据KIF15 的mRNA 水平进行分组，KIF15 的mRNA 水平排序在四分位数P75 及以上的作为KIF15 高水平组，KIF15的mRNA 水平排序在四分位数P25 及以下的作为KIF15 低水平组，比较2 组间所有基因转录水平和中位生存期差异，按照差异倍数在2 或以上，且P＜0.05作为筛选条件，筛选出所有的差异基因（differential expressed genes，DEGs），并以热图的形式进行表示。所有DEGs 进行基因本体（gene ontology，GO）分析和信号通路富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。

四、统计学分析

采用SPSS20.0 软件进行数据分析，转录组mRNAseq 数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间分析采用计量资料的t 检验，免疫组化染色强度评分转化为秩次，比较采用等级资料的Mann-Whitney U 检验，生存分析采用Kaplan-Meier 生存分析法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、KIF15 的正常人体组织及神经系统中的表达特征

在中枢神经系统大脑中，各部位组织可检测到KIF15 的蛋白水平和转录水平均较低。在正常人各组织器官中，KIF15 的蛋白水平均在中等水平或以下，近半数组织器官中几乎不能检测到KIF15 的蛋白表达。其中，KIF15 在中枢神经系统中为低表达。同时，KIF15 的转录水平（mRNA）除在胸腺、睾丸、骨密质中较高外，而在包括中枢神经系统在内的绝大多数各组织器官中极为低下（图1）。

二、胶质瘤患者肿瘤组织KIF15 转录水平的特征

TCGA 和CGGA 转录组数据分析显示，胶质瘤WHO 级别越高，KIF15 的mRNA 水平显著增高，WHO Ⅱ级和Ⅲ级分别与WHO Ⅳ级比较，差异有统计学意义（P＜0.05，图2A～B）。并且，在胶质母细胞瘤中KIF15 的mRNA 水平最高，相比较于星形胶质细胞、少突胶质细胞瘤、少突星形胶质细胞瘤、间变性星形胶质细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤，差异均有统计学意义（P＜0.05，图2C～D）。在中位生存期上，KIF15 高水平组患者的中位生存期较KIF15 低水平组更短，差异有统计学意义（P＜0.05，图2E～F）。胶质瘤组织芯片染色结果显示，WHO 级别越高，胶质瘤组织染色强度评分趋向更高，WHO Ⅳ级胶质瘤评分以2 分（20.51%）、3 分（74.36%）为主，而WHO Ⅱ级以0 分（29.17%）、1 分（50.00%）为主（图2G～H）。

三、KIF15 转录水平与相关肿瘤增殖指标Ki67的相关性

在TCGA 转 录 组 数 据 中，KIF15 和Ki67 的mRNA 水平之间为显著性正相关关系 （r=0.725，P＜0.001，图3A）；在CGGA 转录组数据库中，KIF15 和Ki67 的mRNA 水平之间也呈显著性正相关关系（r=0.706，P＜0.001，图3B）。

四、KIF15 参与调控的分子信号通路

共筛选到707 个DEGs，KIF15 高水平组相比较于KIF15 低水平组，表达水平升高的DEGs 有328个，表达水平降低的DEGs 有379 个（图4A）。GO 分析显示，这些DEGs 参与的生物学过程前10 位包含细胞周期转换和细胞有丝分裂调控（图4B）。分子信号通路富集，KEGG 分析显示，DEGs 参与的分子信号通路包括细胞周期、P53 通路和DNA 复制（图4C）。

讨论

GBM 是脑肿瘤中最为常见且恶性程度最高的肿瘤。胶质瘤内部细胞的异质性以及存在一类“肿瘤干细胞”，可引起术后化学治疗药物的耐受及脱靶效应，以至于常规治疗效果不尽如人意，患者中位生存期较短[1-3]。GBM 的致病基因突变极为复杂，对致病基因的识别是肿瘤精准治疗的前提，目前越来越多的特异性肿瘤靶点被发现，为疾病的个性化治疗提供了科学线索和依据。

图1 KIF15 的正常人体组织及神经系统中的表达特征

图2 KIF15 在胶质瘤中的表达及临床意义

图3 KIF15 转录水平与相关肿瘤增殖指标Ki67 的相关性

图4 KIF15 参与调控的分子信号通路

驱动蛋白家族（kinesin family members，KIFs）是包含40 多个蛋白成员的超家族，参与了细胞内蛋白质和细胞器的运输、细胞有丝分裂等重要过程[10]。在KIFs 家族中，KIF15 是一种基于微管的、正端导向的运动蛋白，参与多种细胞过程，如纺锤体装配、质膜运输和细胞分裂[11-13]。据报道，KIF15 和KIF11 可促进双极纺锤体的形成[14]。近年来研究报道，KIF15 也被证实参与多种肿瘤的生长，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌等[15-18]。但KIF15 在胶质瘤肿瘤中的表达及与预后的关系尚不清楚，国内KIF15 在胶质瘤中的相关报道少见。本研究基于目前全国两大胶质瘤基因谱——TCGA 和CGGA，挖掘了KIF15 在胶质瘤中的表达特征及临床意义，并初步探讨了KIF15 在分子机制上的功能。首先，通过人类基因和蛋白表达数据库探究了KIF15 在健康人神经系统中的表达特征，结果显示，KIF15 在人类绝大部分组织器官中是较低表达的，尤其是在脑组织中蛋白水平和转录水平的表达量均极低。然而，TCGA 和CGGA 胶质瘤患者样本转录组数据提示，无论是在WHO 不同级别分组比较，抑或是根据肿瘤病理学分组比较，均显示KIF15 在胶质母细胞瘤中异常高表达；并且，KIF15 高表达患者的中位生存期显著缩短。由此可见，KIF15 异常高表达与胶质母细胞瘤的发生及临床预后有较大的临床联系，KIF15 很可能是胶质母细胞瘤的一个特征性蛋白标记物。而且，KIF15 的转录水平与肿瘤恶性指标Ki67 存在显著正相关，说明高水平表达KIF15 的胶质瘤细胞增殖能力也相应更强，肿瘤恶性程度更高，因此患者的中位生存期越差。最后，本研究对KIF15 高表达组和低表达组间筛选出的DEGs 进行GO 分析和信号通路KEGG 分析，结果显示，DEGs 显著富集在了细胞增殖相关的生物学过程以及分子信号通路中，如细胞周期、P53等经典肿瘤信号通路。研究已经证实，P53 是重要的抑癌基因，其在通过调控细胞周期检查点上发挥重要的作用，通过对细胞周期的调控影响了肿瘤细胞的恶行增殖速度[19]。这就提示，KIF15 明显参与调控了细胞分裂信号通路。由此，笔者初步得出了KIF15是胶质母细胞瘤的一个特征性标志物，具有重要的临床研究价值。

综上所述，KIF15 在胶质瘤中高表达，并且高水平KIF15 预示胶质瘤恶性程度高，患者生存期较差。KIF15 参与调控了肿瘤细胞周期通路，可能是一个潜在的胶质瘤基因治疗靶点。对于该基因的后续研究，应结合其DEGs 的GO 分析和KEGG 分析结果，着重对P53 信号通路和细胞周期分析信号轴进行研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突