牛蛙血细胞核酸和脊髓运动神经细胞的显色观察*

徐本锦，刘 玲，宣 焱，杜 淼

山西医科大学汾阳学院医学检验系，山西吕梁 032200

核酸的细胞化学染色是利用化学试剂与核酸分子反应生成带颜色的产物，从而达到对细胞内DNA和RNA定位和定性的目的，是细胞遗传学研究的重要手段。1924年有研究者发明了DNA显色的经典方法——福尔根反应[1]。该反应还可用于DNA的化学计量测定[2]、区分肿瘤性质和判断病变程度等[3]。甲基绿-派洛宁染色已被广泛用于细胞内DNA和RNA的显示[4]。

牛蛙具有血细胞大[5-6]、肌肉发达、性情温和等特点，是了解肌肉、呼吸系统、心脏和循环系统[7]结构特征的良好材料。本研究对牛蛙血细胞中的核酸和脊髓运动神经细胞进行了显色，对实验的注意事项进行了分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1一般材料 健康牛蛙数只，染色缸，载玻片，盖玻片，镊子，剪刀，香柏油，擦镜纸。

1.2仪器与试剂 仪器：普通光学显微镜，恒温水浴箱。主要试剂：甲基绿-派洛宁混合液，95%乙醇，1%亮绿染液，1 mol/L HCl，Schiff试剂，1%甲苯胺蓝染液。

1.3方法

1.3.1牛蛙血细胞DNA的福尔根反应显色 具体实验步骤包括：(1)取材。麻醉牛蛙，将其置于一白瓷盘中，腹面朝上，沿着尾部向头部方向依次剪开皮肤和肌肉，找到心脏。剪开心包膜，使心脏完全显露出来，然后在心脏上剪一小口。(2)涂片。取一张干净的载玻片，轻轻蘸取心脏血，以45°夹角在另一张干净的载玻片上轻轻向前推，即可做成血涂片，自然晾干。(3)水解。将血涂片置于室温下的1 mol/L HCl中水解2 min，然后置于60 ℃的1 mol/L HCl中水解8 min，再在室温下的1 mol/L HCl中水解2 min。(4)染色。将血涂片用小流量的水冲洗，除去多余的HCl，然后在血涂片上滴加一层Schiff试剂，染色30 min，再用小流量的水冲洗，然后放入1%的亮绿染液中复染30～60 s，小流量的水冲洗后晾干。(5)镜检。先在低倍镜下找到符合预期实验结果的区域，然后在高倍镜下观察。(6)拍照。拍照记录不同放大倍数的实验结果。

1.3.2牛蛙血细胞DNA和RNA的甲基绿-派洛宁染色 具体实验步骤包括：(1)取材，同上。(2)涂片，同上。(3)固定。在晾干的血涂片上滴加一层95%乙醇，室温固定5 min，然后吸去乙醇再放置5 min。(4)染色。在血涂片表面滴加1层(3～4滴)甲基绿-派洛宁染液，染色20 min后用小流量的水冲洗掉多余染液，再用吸水纸吸去多余水分。(5)镜检。先在低倍镜下找到符合预期结果的区域，然后在高倍镜下仔细观察细胞核与细胞质的颜色。(6)拍照。拍照记录不同放大倍数的显色结果。

1.3.3牛蛙脊髓运动神经细胞的甲苯胺蓝染色 具体实验步骤包括：(1)取材。取小段高位脊髓，置于载玻片上用镊子或牙签将其捣碎。(2)染色。滴加数滴甲苯胺蓝染液，染色5 min左右，然后用小流量的水洗去多余染液。(3)压片。盖上盖玻片，用拇指挤压使脊髓压为一薄层。(4)镜检。先在低倍镜下找到符合预期结果的区域，然后在高倍镜下仔细观察细胞形态特征。(5)拍照。拍照记录不同放大倍数的染色结果。

2 结 果

2.1血细胞DNA的福尔根反应显色 结果显示，福尔根反应后细胞核呈紫红色，细胞质呈绿色(图1A)。随着复染时间的延长(50～60 s)，细胞质呈暗绿色(图1B)。当复染时间为30 s或更短时，细胞质变为浅绿色(图1C)。在显微镜下，还经常可以看到有些细胞核是红色的，有些细胞核颜色很浅或几乎没有红色(图1D～E)。这是由于局部水解不充分或不完全造成的。另外，当复染时间大于60 s时，可以看到部分细胞质颜色变为浅海绿色，细胞核的紫红色也被一定程度覆盖了(图1F中的黑色箭头)。因此，福尔根反应显色血细胞DNA的最佳条件为室温水解2 min，60 ℃水解8 min，再室温水解2 min，Schiff试剂染色30 min，亮绿复染40 s。

注：A 为亮绿复染约40 s(×400)；B为亮绿复染50～60 s (×400)；C为亮绿复染约30 s(×400)；D为亮绿复染约30 s，并且部分水解不充分(×100)；E为水解不充分(×400)；F为亮绿复染60 s或更长时间(×400)。

2.2血细胞DNA和RNA同时显色 血细胞中的DNA和RNA经甲基绿-派洛宁染色后，可以看到细胞核变成了蓝色，细胞质变为粉红色(图2A)或深紫色(图2B～D)。

2.3脊髓运动神经细胞的染色观察 牛蛙的高位脊髓经甲苯胺蓝染色后，可以看到单极形(图3A，以及图3B右上角的黑色实线箭头)、双极形(图3A，以及图3B左下角的黑色实线箭头)或多极形(图3A，以及图3C～D的黑色实线箭头)分枝且具有神经纤维的形态较大的运动神经细胞(深蓝色)。还可以观察到呈圆形、数目较多、形态较小的细胞，为神经胶质细胞(图3A、E，以及图3B～D、F中的黑色虚线箭头)。此外，在运动神经细胞中还能看到染色很深的核仁(图3B～D)。

注：A、C、D为×400放大倍数下的视野；B为×100放大倍数下的视野。

注：A为×100放大倍数下的视野；B～E为×400放大倍数下的视野；F为×1 000放大倍数下的视野。

3 讨 论

细胞化学是研究细胞内化学成分及其在细胞活动中的变化和定位的学科。核酸定位和细胞化学染色是生命科学，特别是遗传学研究的重要手段。DNA细胞技术在评估肿瘤侵袭性方面发挥着重要作用[8]，可以为肿瘤病理分级和临床分期提供有价值的信息。细胞化学染色不仅有助于研究细胞的代谢活动、生理功能，而且对生理和病理情况下血细胞化学成分的变化，各种类型血细胞的鉴别，某些血液病的诊断、治疗及发病机制的探讨均有重要意义。

福尔根反应是一种经典的DNA显色方法，是DNA的特异性反应，核染色质和染色体能够被显色，而含有核糖核酸的核仁和细胞质福尔根反应为阴性。本研究首先利用福尔根反应的原理对牛蛙心脏血细胞中的DNA进行了显色分析。结果显示，血细胞核呈紫红色，亮绿复染后细胞质呈绿色(图1A)、暗绿色(图1B)或浅绿色(图1C)。通过对亮绿复染时间的优化，确定了牛蛙血细胞DNA显色的最佳条件：室温水解2 min，60 ℃水解8 min，再室温水解2 min，Schiff试剂染色30 min，亮绿复染40 s。多年来，关于福尔根反应的影响因素，虽然已有多个报道，但笔者根据自身经验，提出了4点注意事项：(1)血涂片的制作。以45°夹角在另一张干净的载玻片上轻轻向前推，夹角过大或过小，都会影响血细胞在玻片上的分布、数量和形态。切勿来回多次推片，防止玻片之间的切割作用造成血细胞破裂，影响后续实验。(2)HCl水解的时间。福尔根反应的一个关键步骤是DNA经弱酸水解，释放出游离的醛基。如果水解不充分，嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键未断裂或断裂不完全，导致形成的游离醛基变少，进而反应变弱(图1D～E)。另外，如果水解时间过长，则可能使DNA和组蛋白过度降解，也会导致反应变弱，甚至出现阴性结果。(3)Schiff试剂的质量。Schiff试剂的质量直接影响着DNA的呈色反应，应选用质量好的碱性品红来配制Schiff试剂，并注意避光保存，防止因氧化变红而失效。(4)复染时间。亮绿复染的最适时间为40 s(图1A)。若复染时间太短，则亮绿着色太浅，导致细胞质呈现浅绿色(图1C)。如果复染时间太长，细胞质的颜色就会变成浅海绿色，细胞核的紫红色也会被一定程度覆盖(图1F)。福尔根反应有助于人们理解DNA在生物学和遗传学中的作用。此外，Schiff试剂在组织化学研究中被引入，为其他醛基染色剂的开发打下了基础。

核酸的定量检测在研究细胞生长、肿瘤生物学和系统发育关系等方面具有重要意义。甲基绿是一种单组分的核染料，其染色机制涉及静电作用和非离子相互作用[9]。这种非离子反应可能是由于染料嵌入了DNA的嘌呤和嘧啶碱之间造成的[10]。由于具有阳离子性质，甲基绿被认为可与带负电荷的DNA结合，能够实现对组织或细胞内DNA含量的可靠评估。派洛宁Y是一种阴离子染料，不仅能够染色RNA、弹性纤维和肥大细胞颗粒，还能对硫酸黏蛋白进行染色[11]。本研究通过甲基绿-派洛宁染色，对牛蛙血细胞中的DNA、RNA进行了定位分析。结果显示，细胞核呈蓝色，细胞质被染成粉红色(图2A)或深紫色(图2B～D)。本实验有3个需要注意的地方：(1)固定时间。一般情况下用95%的乙醇固定10 min。实际操作时，先固定5 min，然后吸掉乙醇，再等待5 min。(2)染色时间以20 min为宜。(3)多余染料的清洗。多余的染料要用小流量的水冲洗，水流速度不宜过快，否则细胞质的颜色会变浅(图2C)。甲基绿-派洛宁染色法还可用于评估癌前和癌变过程中细胞核和核仁的变化[12]。此外，也可作为常规苏木素-伊红(HE)染色的辅助手段来诊断恶性肿瘤[9,13]和检测细胞凋亡[14-15]。

甲苯胺蓝染色显示脊髓运动神经细胞具有特异性强，无背景着色，结果稳定的特点[16]。本研究用甲苯胺蓝染液对牛蛙的脊髓运动神经细胞进行显色观察，在视野中可见许多染色较深的呈单极形、双极形和多极形分枝的运动神经细胞(图3A～D)。这些细胞个体较大，细胞中央较膨大，称为胞体。此外，运动神经细胞还具有细长的纤维状结构，能够接收和传导刺激，称为神经纤维。运动神经细胞中也可见深蓝色的核仁(图3B～D)。还可以看到许多染色较深的小细胞，即神经胶质细胞。本实验有两个需要注意的地方：(1)取材。取牛蛙高位脊髓，因为高位脊髓中的运动神经细胞数目较多，而低位脊髓中几乎看不到运动神经细胞，只能看到数量较多的神经胶质细胞。(2)压片。一定要确保脊髓被捣碎，然后压为一薄层，否则，只能看到很少的细胞或者几乎看不到细胞。

综上所述，牛蛙是研究核酸在血细胞中的定位和显示神经系统特性的良好材料。在福尔根反应中引入亮绿复染并优化染色时间是一种较好的方法，提高了细胞核与细胞质颜色的对比度，有利于进行后续的核酸定量分析。甲基绿-派洛宁染色能同时对DNA和RNA进行定位和定性分析。1%的甲苯胺蓝染色能很好地显示牛蛙高位脊髓中运动神经细胞的形态。本文系统地分析和讨论了这3个实验的影响因素，对实验过程中可能出现显示不佳的结果也进行了呈现和说明，并提出了操作过程中的注意事项。本研究结果可靠，可重复性好，对实验教学、科学研究以及临床应用都具有一定的理论和实践意义。