肝爽颗粒浸膏减轻对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用机制

吴 桥，余朋飞，毕研贞，王宝增，王子璇，李志杰，陈 煜，段钟平

1 首都医科大学附属北京佑安医院 a.疑难肝病及人工肝中心, b.肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室，北京100069； 2 首都医科大学附属北京天坛医院 感染中心，北京 100070； 3 解放军总医院第五医学中心肝胆外科中心，北京 100039

对乙酰氨基酚(N-乙酰基-对氨基苯酚，APAP)是用于镇痛和解热的常用药物,但过量服用时有很高的毒性，并可以导致急性肝衰竭[1-2]。在欧美国家，高剂量的APAP是药物引起肝损伤的主要原因[3]。在中国，APAP诱发了约0.40%的药物性肝损伤[4]。目前临床治疗药物有限，其特效药乙酰半胱氨酸治疗窗狭窄，迫切需要寻找安全有效的治疗药物。APAP在体内的代谢涉及肝脏Ⅰ相和Ⅱ相酶相关解毒途径。在肝Ⅱ相结合酶[包括UDP-葡糖醛酸糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)和磺基转移酶(sulfotransferases，SULT)]的作用下大约85%的APAP被处理为APAP-gluc和APAP-sulfur，并通过尿液排出[4-5]。 目前广泛认为APAP的毒性产物N-乙酰基-对苯醌亚胺(N-Acetyl-p-benzo-quinoneimine，NAPQI)主要是通过肝 Ⅰ 相反应通过细胞色素P450(CYP)途径(主要是通过CYP2E1/CYP1A2)产生的[4]。在APAP过量的情况下，Ⅱ相反应变得饱和，但NAPQI的过量产生会耗尽肝谷胱甘肽(GSH)并修饰细胞蛋白。这破坏了氧化还原平衡，造成了线粒体损伤，从而导致氧化应激引起的肝损伤[6]。

肝爽颗粒是临床上常见的保肝药物，主要功能为舒肝健脾、清热散瘀、保肝护肝、软坚散结，用于急慢性肝炎、肝硬化、肝损伤。有前期研究[7-8]表明，肝爽颗粒对慢性肝损伤患者具有保护性作用，但其具体机制仍不清楚。目前，氧化应激和线粒体功能障碍被认为是APAP肝细胞毒性的主要细胞过程，因此，抑制氧化应激和改善线粒体功能在减轻APAP诱导的急性肝损伤中具有重要作用[9]。肝爽颗粒及其主要有效成分(柚皮苷)可以抗氧化及降低CYP2E1表达的作用[10-11]，据此笔者推测肝爽颗粒可以有效改善APAP引起的肝损伤。为此建立了体外APAP损伤的细胞模型(HepG2细胞)，验证肝爽颗粒的细胞保护作用及抗氧化作用，检测氧化应激相关指标[GSH、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)]，观察肝爽颗粒对APAP代谢相关的Ⅰ相酶(CYP2E1/1A2)和Ⅱ相酶(UGT1A1/1A3/1A6/2B7、GSTα1/m1、SULT1A1/2A1)的影响，探讨其对线粒体功能[线粒体膜电位、上清谷氨酸脱氢酶(GDH)]的影响，并进一步对机制进行研究，从而为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 实验材料 胎牛血清(SH30406，Hyclone)，APAP(HY-66005，MCE)，0.25%EDTA-trypsin(25200056，Gibco)，肝爽颗粒浸膏(山东步长制药股份有限公司)，RIPA裂解液(R0010，Solarbio)、TRIzol试剂(15596018)、Image-iTTMTMRM Reagent (mitochondrial membrane potential indicator)(I34361)、Hoechst 33342(H3570)购自Invitrogen，AMV逆转录酶系统(TakaRa，大连，中国)、实时荧光定量(RT-PCR)仪器(Stepone plus，Applied Biosystems)，MDA测定试剂盒(TBA法)(A003-1)、ROS测定试剂盒(化学荧光法)(E004)、SOD测定试剂盒(WST-1 法)(A001-3)、GSH测定试剂盒(微板法)(A006-2)、GLDH/GDH测试盒(紫外比色法)(A125)购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验分组设置 本实验设置5组细胞培养组，分别为正常对照组、APAP损伤组、3组不同肝爽颗粒浸膏浓度的损伤保护组。使用20 mmol/L APAP加入细胞培养液孵育24 h构建造体外药物肝损伤模型，损伤保护组提前加用不同浓度肝爽颗粒浸膏(0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml)8 h孵育后加入APAP损伤24 h。

1.3 HepG2细胞培养 HepG2细胞由本实验室保存，用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃，湿度为95%，5% CO2细胞培养箱(购自美国 Thermo Forma公司)中培养。细胞贴壁85%～90%时用 EDTA-胰酶消化，细胞活率在90%以上进行1∶4传代培养。

1.4 体外细胞模型的建立 将HepG2 细胞以2×106/ml接种到6孔板中，每孔2 ml，培养24 h细胞全部贴壁后，分别设对照组、损伤组(20 mmol/L APAP)和3组损伤保护组，提前8 h分别换液加入：正常培养基、正常培养基、0.2 μg/ml肝爽浸膏、1 μg/ml肝爽浸膏、5μg/ml肝爽浸膏对损伤保护组进行预保护，随后换液加入：正常培养基(对照组)、20 mmol/L APAP(损伤组及损伤保护组)进行干预处理。

1.5 MTT实验 将 HepG2 细胞以1×104/ml接种于96孔板，每孔100 μl，培养24 h，细胞全部贴壁后，按1.3步骤进行造模后，加入MTT工作液，用多功能酶标仪在490 nm处检测细胞的存活率，每个浓度设3个重复孔，实验重复3遍。

1.6 GSH、SOD、MDA、ROS检测 将细胞按1.3步骤干预后，弃上清，用PBS清洗1～2遍后，使用RIPA裂解液将细胞裂解下来，取上清，按检测方法参照说明书进行相关实验步骤处理，用多功能酶标仪检测细胞中MDA含量及 GSH、SOD、GDH活性。

1.7 高内涵检测线粒体膜电位 将细胞按1.3步骤干预后，弃上清，用HBSS清洗1～2遍后，将线粒体膜电位染料(Image-iT-TM TMRM Reagent)1∶1000加入HBSS，细胞培养箱内孵育30 min 37 ℃，HBSS洗3遍，加普通培养基，后拍照，3 h后继续拍照。

1.8 RT-PCR及Western Blot检测 RT-PCR：收集上述各组细胞，使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取总RNA。使用随机引物和AMV逆转录酶系统由1 μg RNA合成cDNA。使用ABI StepOnePlus实时PCR系统进行SYBR Green实时逆转录PCR。引物由上海生工公司合成(表1)。以管家基因GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算靶基因的相对表达。

表1 引物序列

Western Blot检测:收集上述各组细胞，提取细胞总蛋白，以BCA法测定蛋白质浓度，每个样品取34 μg蛋白，采用30%丙稀酰胺-甲叉双丙稀酰胺凝胶电泳。用湿转法，转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。用5%BSA-TBST稀释一单克隆抗体4 ℃摇动孵育过夜。次日洗涤后孵育第二抗体，室温摇动40 min，再用TBST洗脱3遍后发光液进行化学显色并拍照。

2 结果

2.1 肝爽颗粒浸膏对APAP引起的肝细胞毒性的影响 APAP组细胞活力明显下降，经肝爽颗粒浸膏预处理后，细胞活力得到改善，尤其1 μg/ml及5 μg/ml两组与APAP组比较有明显统计学差异(P值均<0.05)。加入APAP后细胞培养上清中的AST、ALT、LDH含量显著上升，而肝爽颗粒浸膏的预处理组明显下降，提示肝爽颗粒体外可以保护APAP引起的肝细胞损伤(P<0.05)(表2)。

表2 肝爽浸膏对APAP诱导的HepG2细胞急性损伤的影响

2.2 肝爽颗粒浸膏对APAP诱导的肝脏氧化应激指标的影响 与对照组相比，加入APAP导致细胞内MDA、ROS水平显着增加，GSH水平降低(P值均<0.05)，表明APAP引起了肝细胞的氧化应激反应。APAP还将SOD活性水平降低了20%。肝爽颗粒浸膏预处理以剂量依赖性方式显著阻止了APAP的所有作用(表3)。

表3 肝爽浸膏对APAP诱导的氧化应激指标的影响

2.3 肝爽颗粒浸膏对APAP诱导的肝细胞线粒体损伤的影响 图1使用高内涵荧光实时监测APAP诱导的肝细胞线粒体膜电位变化，可见3 h对照组荧光强度随着细胞的增殖强度变强，而APAP损伤造成荧光强度降低，肝爽颗粒浸膏预处理以剂量依赖性方式增强了线粒体膜电位，保护了线粒体膜的稳定性。为了进一步验证肝爽颗粒浸膏对线粒体损伤的保护作用，检测了不同组别上清中GDH的含量，可见1 μg/ml及5 μg/ml肝爽颗粒浸膏处理组的GDH显著下降(表4)。

表4 肝爽浸膏对APAP诱导的线粒体损伤的影响

2.4 肝爽颗粒浸膏对CYP2E1/1A2表达的影响 通过RT-PCR检测CYP2E1/1A2 mRNA表达水平，观察到单独使用APAP可以提高CYP2E1/1A2 mRNA水平。而与此同时，1 μg/ml及5 μg/ml肝爽颗粒浸膏可以抑制CYP1A2表达，同时显著抑制CYP2E1表达(表5)。

表5 肝爽浸膏对不同组别CYP2E1/1A2 mRNA表达水平的影响

2.5 肝爽颗粒浸膏对肝细胞Ⅱ相酶表达的影响 如图2所示，Ⅱ相酶水平受最低剂量的肝爽颗粒浸膏影响。与对照组相比，单用APAP显著下调了肝脏Ⅱ相酶的表达。同样，肝爽颗粒浸膏以剂量依赖性方式使Ⅱ期酶的mRNA水平升高。 最终剂量为5 μg/ml的损伤保护组显著选择性地上调了Ⅱ期酶的靶基因，导致上调程度比对照组高785%、936%、1275%和725%分别为UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6和SULT2A1。

注：高内涵监测不同组别0、3 h后线粒体膜电位TRME强度。

注：与APAP组相比,*P<0.05，**P<0.001。

2.6 肝爽颗粒浸膏可以诱导Nrf2及其下游基因的表达

使用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR检测肝细胞系中Nrf2的表达。与对照组相比，在预处理组中，Nrf2的蛋白质水平及mRNA水平显示均展现出上升的趋势(P值均<0.05)(图3，表6)。 此外，与单独的APAP组相比，1 μg/ml及5 μg/ml肝爽颗粒浸膏预处理组的GCLC及NQO-1(Nrf2的靶基因)mRNA水平的表达显著增强(P值均<0.05)(表6)。

注：Western Blot检测不同组别Nrf2蛋白水平表达结果。

3 讨论

APAP诱导的肝损伤是发达国家急性肝衰竭的主要原因。由于现有的治疗方法有限，因此迫切需要开发新的治疗方法。氧化应激在APAP诱导的肝损伤中起到了至关重要的作用。在之前的文章报道中，肝爽颗粒已经显示出抗氧化的能力。根据现有研究，笔者以经APAP处理的HepG2细胞为体外肝损伤模型进行肝爽颗粒保护作用研究。APAP可被CYP2E1/1A2酶代谢为NAPQI，其可以与GSH发生化学和酶结合，这可能导致脂质过氧化、硝化蛋白和随后的线粒体损伤[12]。已有研究[13-14]表明，APAP过量可降低抗氧化酶活性，一些药物已被证实可以恢复酶的部分功能。在本研究中，APAP使肝细胞内GSH、SOD浓度减少，MDA、ROS浓度升高，这些都是氧化应激的指标。肝爽颗粒浸膏预处理的细胞组较APAP组抗氧化酶水平升高，ROS、MDA浓度降低。这些数据表明，肝爽颗粒浸膏可以提高抗氧化酶水平，从而对APAP诱导的氧化应激反应起到了保护作用。APAP可导致肝脏中CYP2E1/1A2表达增加，肝爽颗粒浸膏可显著抑制CYP2E1/1A2的表达，减少了毒性代谢产物NAPQI的产生，同时也提高抗氧化酶的水平，这可能就是肝爽颗粒具有较强的抗氧化作用的原因。UGT、SULT和GST等 Ⅱ 相酶的催化代谢对于APAP无毒代谢有着重要作用，APAP在肝脏中经历 Ⅱ 期解毒途径，约85%的APAP被包括UGT和SULT在内的 Ⅱ 相肝酶以APAP-gluc和APAP-sulf的形式处理代谢掉[15]。在本研究中，有7种Ⅱ相酶(UGT1A1/1A3/1A6、SULT1A1/2A1、GSTα1/m1)参与了APAP的解毒，它们是UGT、SULT和GST的主要酶和主要亚型。本研究明确了大部分Ⅱ期酶mRNA的表达由肝爽颗粒浸膏调节呈剂量依赖性增加。同时，肝爽颗粒浸膏显著提高了UGT1A9和SULT2A1的mRNA水平。本研究结果表明，Ⅱ相酶的调节可能参与了肝爽颗粒浸膏保护肝细胞损伤的机制。线粒体功能障碍在APAP诱导的肝细胞毒性中起重要作用，最小化线粒体损伤和/或增强线粒体功能的治疗可以提高APAP诱导的肝损伤中的肝细胞存活率和治疗结果[9]。不同浓度的肝爽颗粒浸膏预处理组的线粒体膜电位得到了不同程度的恢复，线粒体损伤指标GDH呈现剂量依赖性下降。

Nrf2激活是诱导Ⅱ相酶表达的关键。Nrf2的重要性是非常明确的，有报道[16-17]显示，在Nrf2缺陷小鼠中，Ⅱ相酶基因水平显著降低。本研究结果显示，肝爽颗粒浸膏显著增加了SULT和UGT的水平。此外，有报道[18]表明，Nrf2缺失小鼠对APAP诱导的肝损伤表现出更高的易感性，这表明Nrf2是肝保护的一个靶点。Nrf2是一种CNC-bZIP蛋白，被认为是氧化防御的主要调节因子。肝爽颗粒浸膏预处理诱导肝细胞组Nrf2蛋白水平和mRNA水平表达均有不同程度上调。有学者[19]发现，通过上调HepG2细胞的Nrf2来激活GCLC，GCLC是谷胱甘肽(细胞中主要的抗氧化剂分子)合成中的主要限速酶[20]。肝爽颗粒浸膏可增加Nrf2下游基因GCLC及NQO-1的mRNA水平的表达，导致GSH水平升高。上述结果表明，Nrf2参与了肝爽颗粒浸膏诱导的解毒和抗氧化信号通路。

表6 肝爽浸膏对Nrf2、GCLC及NQO-1 mRNA水平的影响

本研究认为肝爽颗粒浸膏可通过两种途径预防APAP诱导的肝细胞损伤，第一种途径是肝爽颗粒浸膏下调CYP2E1/1A2的表达，从而降低了APAP产生的有毒物质NAPQI浓度；第二种途径是肝爽颗粒浸膏上调解毒通路的表达,它能激活Nrf2增加抗氧化酶(SOD、GSH)和Ⅱ相酶的表达，从而加速APAP的无害代谢。综上所述，肝爽颗粒浸膏作为一种天然药物的复合物，对APAP的解毒有着有益的影响，并通过Nrf2的激活，与CYP2E1活性的抑制以及抗氧化酶和Ⅱ期酶的上调有关。总之，肝爽颗粒是一种有希望用于治疗APAP引起的肝损伤药物。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：吴桥负责课题设计，资料分析，撰写论文；余朋飞负责细胞实验、指标检测；毕研贞负责高内涵检测及ROS数据的采集；王宝增、王子璇、李志杰参与收集数据，修改论文；陈煜、段钟平负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。