平菇多糖硫酸酯制备工艺优化及抗氧化活性研究

梁 英 毕红梅 郑文凤 毕洪梅 李志江

(1.黑龙江八一农垦大学理学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品院，黑龙江 大庆 163319；3.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319)

平菇又称白蘑，学名侧耳，属担子菌门下伞菌目侧耳科，是药食两用菌。平菇易于栽培，营养丰富且富含多糖[1]，是获取多糖物质的极好原料。据报道[2-4]，平菇多糖(Pleurotusostreatuspolysaccharides，POP)具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂和免疫调节等多种生物活性。但因水溶性较差，其生物活性的发挥受到了一定的限制。对多糖进行化学修饰，可有效地改变多糖的化学结构，从而改变多糖的理化性质，提高其生物活性[5]。天然多糖硫酸酯和化学修饰后的多糖硫酸酯是目前研究较多的一大类多糖，硫酸酯化是多糖改性的最常用方法，已成为近年来研究的热点，受到很多学者们的极大关注[6-8]。研究表明，多种食用菌多糖经硫酸化修饰后，不但提高了原多糖的水溶性，其抗氧化[9-11]、抗肿瘤[12-13]、抗病毒[14]、抗凝血[15]、降血脂[16]、保护神经细胞[17]等作用也明显增强。近年来，对多糖硫酸酯的合成、表征和生物活性的研究促进了多糖硫酸酯在食品工业和医药领域的应用[18]。但对平菇多糖硫酸酯的制备及生物活性研究中国未见报道。

研究拟以从平菇子实体中提取的平菇多糖为原料，采用浓硫酸法对平菇多糖硫酸酯的制备工艺进行优化，鉴定平菇多糖硫酸酯的结构并考察其抗氧化活性。旨在为平菇多糖硫酸酯在药物和抗氧化保健功能性食品的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

平菇多糖：纯度为87.56%，实验室自制；

无水乙醇、浓硫酸、正丁醇、硫酸钾、三氯化铁、抗坏血酸、邻苯三酚、抗坏血酸、水杨酸、过氧化氢：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

三羟甲基氨基甲烷：生化试剂，美国Sigma公司；

DPPH：分析纯，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：ALC-310.3型，上海精密科学仪器有限公司；

旋转蒸发器：RE-5299型，巩义市黄山谷予华仪器厂；

紫外分光光度计：T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司；

傅立叶变换红外光谱仪：Nexus 670FT-IR型，美国Thermo Nicolet公司；

离心机：LXJ-IIB型，上海安亭科学仪器厂；

恒温水浴锅：HWS24型，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 平菇多糖硫酸酯的制备 取一定体积的浓硫酸与5 mL含有0.063 g (NH4)2SO4的正丁醇溶液混合，置于三颈圆底烧瓶中，装上干燥管和搅拌器，冰浴冷却到0 ℃，磁力搅拌30 min，缓慢加入1.00 g平菇多糖，在一定温度下进行反应。反应结束后，离心(3 000 r/min，10 min)分离，残留物用5% NaAc溶液中和，产物用重蒸水透析24 h，然后加入5倍体积的无水乙醇沉淀，减压抽滤，用无水CaCl2干燥，得到的白色晶体即为平菇多糖硫酸酯。

1.3.2 平菇多糖硫酸酯制备的单因素试验设计

(1) 浓硫酸加入量对平菇多糖硫酸酯取代度的影响：固定平菇多糖质量1.00 g、反应时间90 min、反应温度20 ℃，浓硫酸加入量分别为6，8，10，12，14 mL，按1.3.1进行操作并计算取代度值。

(2) 反应温度对平菇多糖硫酸酯取代度的影响：固定平菇多糖质量1.00 g、浓硫酸加入量10 mL、反应时间90 min，反应温度分别为20，40，60，80，100 ℃，按1.3.1进行操作并计算取代度值。

(3) 反应时间对平菇多糖硫酸酯取代度的影响：固定平菇多糖质量1.00 g、浓硫酸加入量10 mL、反应温度20 ℃，反应时间分别为30，60，90，120，150 min，按1.3.1进行操作并计算取代度值。

1.3.3 平菇多糖硫酸酯制备的正交试验设计 在单因素试验的基础上确定正交试验的因素水平，采用L9(34)表进行正交试验，对平菇多糖硫酸酯的制备工艺进行优化。

1.3.4 考察指标测定

(1) 硫酸基含量的测定及取代度计算：采用BaCl2凝胶法[19]测定硫酸基含量，以K2SO4溶液绘制标准曲线，在360 nm波长下测定吸光度，由回归方程计算硫酸基含量，再根据式(1)计算取代度。

(1)

式中：

DS——取代度；

S——硫含量，%。

(2) 红外光谱分析：称取5 mg的平菇多糖或平菇多糖硫酸酯与适量的KBr压片，用FT-Iris5型傅立叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1波数范围扫描，得到红外吸收光谱图进行分析，确定平菇多糖硫酸酯的合成情况。

(3) 相对还原力：参照文献[20]，以抗坏血酸作阳性对照，在700 nm处测定吸光度，每个样品重复3次，取平均值。吸光度越大，还原能力越强。

(4) 超氧阴离子自由基清除能力：采用邻苯三酚自氧化法[20]，以抗坏血酸作阳性对照，在325 nm 处测定吸光度值，重复3次，取平均值。

(5) DPPH自由基清除能力：参照文献[20]，以抗坏血酸作对照，在517 nm 处测定吸光度值，重复测定3次，取平均值。

(6) 羟自由基的清除能力：采用Fenton反应体系[20]，以抗坏血酸作阳性对照，重复测定3次，取平均值。

1.4 数据处理

试验数据处理采用SAS 9.1软件，结果用(平均数值±标准偏差)表示，P<0.05为差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 平菇多糖硫酸酯制备工艺优化

2.1.1 单因素试验 由图1(a)可知，随浓硫酸加入量的增大，取代度先增加，当硫酸加入量为10 mL时取代度最大(为0.40)，之后开始降低。可能是浓硫酸加入过多，放热过快造成多糖碳化，同时还会导致多糖部分降解的缘故。因此，浓硫酸最佳加入量为10 mL。

由图1(b)可知，反应温度在20～60 ℃时，随温度升高，取代度缓慢增加；当温度为60 ℃时，取代度达到最高，为0.47；当温度超过60 ℃时取代度明显降低。说明温度过高也可造成平菇多糖碳化，不利酯化反应。因此，最佳反应温度为60 ℃。

由图1(c)可知，反应初期，随反应时间的延长，平菇多糖的取代度明显提高，1.5 h时达最高(为0.42)，之后取代度有所降低。可能是因为浓硫酸的强氧化性及长时间作用引起多糖分子链发生断链和脱水焦化等副反应，致使取代度下降[21]。因此，最佳反应时间为1.5 h。

图1 浓硫酸体积、反应温度和反应时间对平菇多糖硫酸酯取代度的影响Figure 1 The effects of sulphuric acid volume,temperature and time on the degree of substitution of polysaccharide of Pleurotus ostreatus

2.1.2 正交试验 在单因素试验结果的基础上确定正交试验的因素水平，见表1。

由表2可知，浓硫酸加入量影响最大，反应温度次之，影响最小的是反应时间；空列的R值与反应时间的R值相等，可能是因素间存在一定的交互作用所致。优化参数为A2C2D2，即平菇多糖质量1.00 g，浓硫酸加入量10 mL，反应温度60 ℃，反应时间90 min。按此组参数重复3次验证实验，平菇多糖取代度为0.48，高于其他组合，因此优化工艺为平菇多糖质量1.00 g，浓硫酸加入量10 mL，反应温度60 ℃，反应时间90 min。

2.2 红外光谱分析

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

2.3 体外抗氧化活性

平菇多糖和平菇多糖硫酸酯的抗氧化活性试验结果见图3。

由图3(a)可知，在试验浓度范围内，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯的还原能力与样品浓度呈正相关，浓度越大，还原能力越强，二者还原能力相当，低于对照组维生素C(P<0.01)。

由图3(b)可知，质量浓度为0.5～3.0 mg/mL时，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基的清除能力随着质量浓度的增加，一直明显增加。当质量浓度达到3.0 mg/mL时，平菇多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基的清除率达到了70.12%；但低于质量浓度为1.5 mg/mL的维生素C的清除率，与维生素C对照组比较差异显著(P<0.01)。维生素C、平菇多糖和平菇多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基的IC50(半数清除率)分别是0.668，2.321，1.882 mg/mL，平菇多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基的清除能力好于平菇多糖。

由图3(c)可知，质量浓度为0.5～1.5 mg/mL时，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯对DPPH自由基的清除能力随浓度的增加极显著增加(P<0.01)，质量浓度为1.5～>3.0 mg/mL 时，对DPPH自由基的清除能力增强缓慢，差异不显著；平菇多糖硫酸酯对DPPH自由基的清除能力与对照组维生素C差异不显著，平菇多糖对DPPH自由基的清除能力与对照组维生素C差异显著(P<0.05)；当质量浓度为3.0 mg/mL时，平菇多糖硫酸酯、平菇多糖、维生素C对DPPH自由基的清除率分别为85.78%，77.45%，90.23%。维生素C、平菇多糖和平菇多糖硫酸酯对DPPH自由基的IC50(半数清除率)分别是0.523，0.999，0.816 mg/mL，平菇多糖硫酸酯对DPPH自由基的清除能力好于平菇多糖。

图2 平菇多糖和平菇多糖硫酸酯FT- IR光谱Figure 2 FT-IR absorbance spectrums of POP and POPS

由图3(d)可知，质量浓度为0.5～3.0 mg/mL时，平菇多糖和平菇多糖硫酸酯对羟基自由基的清除能力随质量浓度的增加而增大。维生素C对羟基自由基的清除能力在质量浓度为1.5 mg/mL时基本达到最高，随着质量浓度的增加，维生素C的清除率趋于稳定。当质量浓度为3.0 mg/mL时，平菇多糖硫酸酯的清除率达到了78.42%。当质量浓度为1.5 mg/mL时，维生素C的清除率达到了91.28%，与对照组比较差异显著(P<0.01)。维生素C、平菇多糖和平菇多糖硫酸酯对羟基自由基的IC50(半数清除率)分别是0.635，2.083，1.611 mg/mL，平菇多糖硫酸酯对羟基自由基的清除能力好于平菇多糖。

图3 平菇多糖和平菇多糖硫酸酯的还原力和自由基清除能力Figure 3 Reductive power and scavenging ability to free radicals of POP and POPS

综上，平菇多糖硫酸酯对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力均好于平菇多糖，与前人[9-10，22-24]研究结果一致。可能是多糖引入硫酸基后，改变了多糖的水溶性、光学活性和空间构象，从而使其性质有所不同，引起生物活性发生改变[16，22，25]。

3 结论

试验采用浓硫酸法成功制备了平菇多糖硫酸酯，通过正交试验获得了制备优化工艺，即平菇多糖质量1.00 g，浓硫酸加入量10 mL，反应温度60 ℃，反应时间90 min，取代度为0.48。红外吸收光谱分析证明平菇多糖是吡喃型多糖。平菇多糖和平菇多糖硫酸酯都具有较好的抗氧化性，但平菇多糖硫酸酯的抗氧化性强于平菇多糖，说明食用菌多糖经硫酸修饰后抗氧化能力增强。综上，制备平菇多糖硫酸酯的原料来源丰富，工艺简单，对平菇多糖硫酸酯的批量生产有重要的现实意义，同时平菇多糖硫酸酯的抗氧化性有着较好的应用价值，在药物和抗氧化保健功能性食品领域会有长远的发展。平菇多糖硫酸酯的其他生物活性及取代度不同对其生物活性的影响还有待进一步研究。