DINP的健康效应及机理研究进展

孙蕾，李洪祥，刘敏，叶婷，王佳,*

1. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)，泰安 271016 2. 贵阳学院，贵阳 550005

邻苯二甲酸二异壬酯(di-isononyl phthalate, DINP)是一种高分子量的人工合成增塑剂，95%添加于常见的聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)塑料制品中增加塑料的可塑性和耐久性，包括食品包装、化妆品、玩具、油漆、聚氯乙烯地板、润滑油和粘合剂等[1]。DINP与塑料基质以非共价形式结合，易释放到环境中，并通过呼吸吸入、皮肤接触和饮食摄入等多种途径被人体吸收[2-3]。动物实验以及流行病学研究发现，DINP具有危害内分泌系统、生殖发育系统、皮肤、消化系统、神经系统、呼吸系统和免疫系统等多种毒性作用[4]。DINP等增塑剂污染已成为威胁人类健康的重要问题，受到国内外越来越多的关注。美国环境保护局(US Environmental Protection Agency, US EPA)已将包括DINP在内的多种邻苯二甲酸盐列入潜在内分泌干扰物清单[5]。我国积极修订中华人民共和国国家标准《玩具安全 第1部分：基本规范》(GB 6675.1—2014)，控制DINP在儿童护理用品及玩具中的添加量[6]。

本文结合国内外文献，从一般毒性、内分泌毒性及生殖发育毒性等角度系统地对DINP的毒性作用及机制研究进行综述，为DINP的健康风险评估及毒理学研究提供依据和参考。

1 DINP的人体暴露与代谢(Human exposure and metabolism of DINP)

随着PVC塑料制品的使用，DINP不断进入生态环境中，DINP可通过消化道、呼吸道和皮肤接触多种途径进入人体，婴幼儿、儿童由于接触塑料玩具等制品，DINP暴露量通常高于成人[7]。Al Qasmi等[8]研究了卡塔尔11个家庭及1个医院室内粉尘中的邻苯二甲酸盐浓度，发现家庭DINP浓度中值为101 μg·g-1，占总邻苯二甲酸盐的23%；医院大楼DINP浓度中值为19 626 μg·g-1，占总邻苯二甲酸盐的94%；进一步研究了成人、婴幼儿体内的非饮食暴露量，发现婴幼儿每日暴露量(1 736 ng·kg-1)远高于成人(225 ng·kg-1)，其原因可能是婴幼儿比成人更容易通过地板灰尘接触邻苯二甲酸酯、婴幼儿体表面积与体积之比高于成人以及他们之间行为和生理差异。Zhang等[9]对中国天津市和沧州市农村家庭室内尘埃中邻苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)的含量进行了研究，发现天津市家庭室内尘埃中PAEs的含量远高于沧州市农村地区；DINP、DEP和DNBP的浓度中值分别为0.28、0.31和42.6 μg·g-1，且DINP浓度与现代地板材料(胶合板/木地板)的使用密切相关(P<0.05)。

DINP在一期代谢过程形成初级代谢物水解单酯，进一步经过氧化反应生成次级代谢物邻苯二甲酸单羧基异辛酯(MCIOP)、邻苯二甲酸单羟基异壬酯(MHINP)和邻苯二甲酸单异壬酯(MOINP)。人类生物监测研究表明，几乎所有受试尿液样本都检测到DINP的主要代谢产物MHINP，只有约10%的样本检测到初级代谢物邻苯二甲酸单(3,5,5-三m乙基己基)酯(MiNP)，表明次级代谢产物可作为检测DINP暴露的敏感生物标志物[10]。Iwata等[11]进行DINP药物代谢动力学研究，发现人源化肝脏小鼠与对照组TK-NOG小鼠的主要循环代谢产物不同，分别是MiNP的氧化产物(羧基MiNP、羟基MiNP和氧代MiNP)及其葡萄糖醛酸苷和MiNP，表明不同物种肝脏代谢的差异可能是影响DINP在体内代谢处置的决定因素。

2 DINP的健康效应(Health effects of DINP)

2.1 内分泌毒性作用

动物实验研究表明，DINP存在明显的内分泌干扰活性作用。Forner-Piquer等[12]研究了DINP对成年雄性吉列海鲷内分泌功能的影响，考察了DINP对内源性大麻素系统(endocannabinoid system, ECS)的调节作用。结果表明，DINP通过参与脂质生物合成影响ECS代谢基因转录水平，进而改变肝脏内大麻素和大麻素样介质的水平使得成年雄性吉列海鲷的内分泌调节紊乱。食用DINP的海鲷肝脏结构和生化成分发生了改变，脂质和甘油三酯的含量增加，糖原和磷脂的含量降低。Ghisari和Bonefeld-Jorgensen[13]利用甲状腺激素(thyroid hormone, TH)依赖性大鼠垂体GH3细胞增殖实验研究了DINP、邻苯二甲酸(2-乙基己基酯)(diethylhexyl phthalate, DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、邻苯二甲酸二异癸酯(diisodecyl phthalate, DIDP)、邻苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate, DOP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(butyl benzyl phthalate, BBP)等6种增塑剂的甲状腺激素干扰活性作用，并利用雌激素受体(estrogen receptor, ER)荧光素酶报告载体稳定转染的MVLN细胞分析了这些增塑剂的雌激素干扰活性作用，发现这些增塑剂具有内分泌干扰作用，此作用是通过干扰雌激素和甲状腺激素系统进行调节的。Duan等[14]对自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases, AITD)模型大鼠腹腔注射不同浓度DINP，研究发现，高剂量DINP(1.5 mg·kg-1和15 mg·kg-1)暴露加剧氧化应激，激活Akt/mTOR信号转导通路，进而抑制正常自噬过程、促进甲状腺中IL-17高表达，加剧了自身免疫性甲状腺疾病。

2.2 生殖发育毒性作用

越来越多的证据表明，DINP具有危害生殖健康的毒性作用。流行病学研究发现，男性在出生前、后接触邻苯二甲酸盐与生殖发育异常密切相关，可能是DINP强烈的抗雄激素作用所致[15]。国内外动物实验研究表明，DINP可引起大鼠/小鼠睾丸组织病理学损伤及生理生化指标改变。Borch等[16]用DINP(750 mg·kg-1)对妊娠期和哺乳期大鼠每天进行灌胃处理，结果显示，妊娠第21天雄性子代睾丸和血浆中睾酮水平降低。陈莹莹等[17]研究发现，20 mg·kg-1或更高剂量的DINP灌胃处理导致成年昆明系雄性小鼠(23～25 g)睾丸组织病理损伤，损伤程度与暴露剂量呈正相关。DINP对雌性的影响具有双重性，低剂量时主要干扰类固醇的生成和卵母细胞生长，而高剂量则影响卵母细胞的成熟[18]。Boberg等[19]对妊娠期Wistar大鼠进行DINP灌胃处理(妊娠第7天至产后第17天)，利用Morris水迷宫研究发现，DINP暴露影响子代大鼠的空间学习能力，并导致雌性子代的行为具有雄性化特征。对于亚慢性接触DINP的研究，Chiang和Flaws[20]对成年CD-1雌性小鼠连续灌胃DINP(20 μg·kg-1～200 mg·kg-1)10 d，分别在给药结束后、3个月后和9个月后与雄鼠配对进行育种试验，结果显示，DINP暴露对雌性小鼠生殖系统有不利影响(包括生殖器官重量变化、动情周期中断、生育力降低、交配行为变化以及产仔结果的变化)。目前，人们可在较短时间内通过检测邻苯二甲酸盐暴露的敏感生物标志物测定人体暴露于DINP引起的生殖发育方面的影响[15]。

另外，DINP暴露还会对肠道及骨骼发育产生不利影响。Setti等[21]用DINP(380 mg·kg-1)对Wistar雌性大鼠(妊娠第8天到出生后第30天)灌胃处理，发现DINP处理组大鼠机体和器官的质量显著降低(P<0.001)，且十二指肠中缺乏肠腺，小肠绒毛萎缩严重。Carnevali等[22]采用DINP污染的饲料喂养乌颊鱼并观察对其肌肉大分子组成和质地变化的影响，发现DINP(15 μg·kg-1)暴露引起饱和链和不饱和链甘油三酯减少、脂肪含量降低、钙蛋白和组织蛋白酶水平降低、协调蛋白的转换紊乱，这表明DINP污染的饮食会导致骨骼肌成分和质地改变。

2.3 免疫毒性

流行病学调查研究表明，接触邻苯二甲酸盐会促进儿童过敏性疾病发展[23]，增加患过敏性皮炎的概率，甚至使其变为易感染体质或加重病情[24]。动物实验研究表明，DINP可以加剧小鼠过敏性皮炎症状。Kang等[25]研究发现，经口摄入DINP加重异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)引起的小鼠变应性接触性皮炎，促进小鼠皮肤水肿加重，血清总免疫球蛋白E和辅助性T细胞(helper T cell, Th)2增加，这种促皮炎作用通过核因子κb(nuclear factorκB, NF-κB)信号通路调节。张焕云等[26]研究发现，小鼠经皮肤持续暴露于DINP(14 mg·kg-1和140 mg·kg-1)40 d，加重了由FITC和DBP混合致敏剂引起的机体氧化应激和炎症反应，且呈剂量依赖性，表明DINP对小鼠过敏性皮炎有明显的佐剂作用。另外，DINP与过敏性哮喘的疾病发展密切相关。Li等[27]研究发现，Balb/c小鼠经口饲喂DINP(2～200 mg·kg-1)与卵清蛋白(ovalbumin, OVA)15 d，诱导气道高反应性，加重气道壁重塑，该症状与免疫球蛋白E和Th2细胞因子分泌增加有关，表明DINP可以影响肺功能、引起肺组织病理学变化、诱导免疫分子表达及引起肺组织氧化损伤，从而与OVA协同(或佐剂作用)促进过敏性哮喘的免疫应答，并推测DINP的佐剂效应可能是由Th1/Th2免疫应答失衡引起的。

2.4 心血管毒性

近年来，有关PAEs与心血管危险因素(如肥胖、Ⅱ型糖尿病和高血压)关系的研究越来越多[28]。已有研究发现，PAEs通过其与过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARγ)受体的结合和激活导致脂肪细胞生成的上升，从而导致肥胖。DEHP的主要代谢物邻苯二甲酸单乙基己基酯(mono-2-ethylhexyl phthalate, MEHP)直接结合并激活PPARγ受体，从而促进脂肪生成；PAEs干扰胰岛素信号通路，促进氧化应激，诱导胰岛素抵抗的发生；对2003—2008年参与美国健康与营养调查的6～19岁儿童的研究表明，DEHP暴露与血压密切相关。DEHP的代谢物邻苯二甲酸单苄酯(monobenzyl phthalate, MBzP)以及DBP的代谢物邻苯二甲酸单乙酯(monoethyl phthalate, MEP)与舒张压密切相关。最近研究表明，PAEs在动脉粥样硬化和高血压发病过程中起重要作用，PAEs相关的高血压可能与动脉粥样硬化斑块回声增加、内膜中层增厚和回声增加有关[28]。血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)超家族成员，AT1R的激活能诱发高血压、动脉粥样硬化及心衰等心血管疾病[29]。Deng等[30]发现C57/BL6小鼠经口及皮下注射方式暴露于DINP(0.15～15 mg·kg-1)6周后，血管紧张素转化酶表达增加，AT1R受体活化，eNOS的表达降低和NO的生成减少，血管阻力增加，增强血管收缩，进而引起血压升高。PAEs暴露对心血管健康的影响与机制仍需进一步研究。

2.5 神经毒性

人类神经系统中的成熟神经元不能增殖以进行自我修复，因而很容易受到环境污染物的影响。尽管DINP暴露相关的其他毒性效应研究较多，但神经毒性作用研究较少。Ma等[31]研究了口服DINP对5～6周龄昆明鼠的神经毒性作用，通过Morris水迷宫实验及旷场试验发现，DINP(20 mg·kg-1和200 mg·kg-1)可引起小鼠运动减少、认知缺陷及焦虑等行为学改变；脑组织病理学研究表明，DINP显著增加小鼠脑组织中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β水平，诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，并引起小鼠大脑海马CA1区锥体细胞损伤、脑细胞凋亡增加，细胞损伤的表现包括导致细胞排列松散无序、细胞形状肿胀变形、顶树突缩短甚至消失和尼氏体减少等；免疫组化结果显示，DINP引起半胱氨酸蛋白酶-3在CA1区和大脑皮层的表达均增加，星形胶质细胞标志物GFAP的表达急剧增加，激活了星形胶质细胞，改变了运动神经元的形状和功能，从而，炎症的增加引发氧化应激并最终导致小鼠脑损伤及行为改变。

3 DINP的毒作用机理(Toxic effect of DINP and its mechanism )

3.1 DINP活化NF-κB，促进ROS生成

NF-κB是许多信号通路中的关键因子，比如炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等。NF-κB通路的激活与内分泌有关且能促进炎症因子的表达[32]。Kang等[33]研究发现，小鼠经FITC致敏的同时经口暴露DINP，激活NF-κB信号通路促进胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)的生成，进而激活瞬时受体电位锚蛋白1(transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1)的活性，提高TRPA1表达，促进IL-6和Th2等细胞因子的分泌，从而加剧小鼠过敏性皮炎症状。另外，他们发现DINP与FITC混合暴露能促进ROS生成，激活转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3, STAT 3)、STAT 5和STAT 6，进而开启致敏过程、加重变态反应性皮炎[24]。Duan等[32]研究发现DINP和甲醛均可引起氧化应激及NF-κB活化，从而导致脑内促炎症因子表达增加，加重大脑神经炎症。

3.2 DINP调节Th1/Th2平衡

辅助性T细胞可分泌细胞因子并参与人体多种免疫，其中Th1介导细胞免疫，Th2介导体液免疫，Th1/Th2在体内处于动态平衡，从而保证人体免疫系统处于平衡状态。当有病原菌侵入时，Th1/Th2平衡发生相对偏移，导致人体免疫倾向于细胞免疫或者体液免疫，达到杀灭病原体的作用，之后再分泌有抑制作用的细胞因子，使之恢复平衡，防止免疫作用扩大。Hwang等[34]研究发现，DINP通过调节Th1/Th2平衡诱导哮喘发生，DINP促进CD4+T细胞对Th2的极化、抑制Th1极化，打破Th1/Th2平衡进而诱导哮喘。另外，DINP可诱导Th2型免疫应答相关细胞因子(IL-4和IL-5等)及免疫球蛋白(IgE和IgG1)表达增加，降低Th1应答相关的IFN-γ和IgG2a水平，并且促进炎症细胞浸润和过碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff stain, PAS)阳性的杯状细胞增生，诱导半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1和caspase-3的表达，从而诱导气道炎症。

3.3 DINP激活PI3K/Akt/mTOR信号转导通路

磷酸肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信号通路参与调控细胞的存活、生长增殖、迁移及糖代谢等过程。Chen等[35]研究发现，DINP(50 mg·kg-1)促进幼鼠肺阻力增加、Akt磷酸化和NF-κB核转位增强，Th2细胞因子水平增加，这表明DINP通过激活PI3K/Akt信号通路提高Th2细胞因子水平，进而增强OVA诱导的过敏性气道反应。哺乳动物的mTOR可负调控甲状腺细胞的自噬，Akt/mTOR通路可直接调控自噬。DINP(15 mg·kg-1)抑制甲状腺细胞的正常自噬和IL-17的表达，提高甲状腺中ROS水平加重氧化应激，激活Akt/mTOR通路，进而加重自身免疫性甲状腺疾病，采用维生素E阻断氧化应激或Akt/mTOR通路阻断剂雷帕霉素可减轻自身免疫性甲状腺病(AITD)的病情和抑制正常的自噬作用[14]。

3.4 DINP影响内源性大麻素系统

内源性大麻素系统(endocannabinoid system, ESC)是细胞内一种信号系统，影响睡眠、食欲、疼痛、炎症、记忆、情绪和生殖等，有助于调节人体所有主要系统的平衡，确保所有系统能彼此协同工作。随着脂肪酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase, FAAH)活性的增加，DINP(1.5 mg·kg-1)降低了内源性大麻素和内源性大麻素类介质的水平，通过降低11-酮基睾酮(11-ketotestosterone, 11-KT)显著影响类固醇生成，从而在繁殖季节对雄性平头海燕的内分泌系统产生不利影响[36]。

4 总结展望(Conclusion and prospects)

塑化剂DINP的暴露在人类整个生命周期中广泛存在，DINP能通过激活NF-κB、促进ROS生成、调节Th1/Th2平衡、激活PI3K/Akt/mTOR信号通路等过程作用于人体，在一定程度上对机体的生殖发育系统、内分泌系统、心血管系统、免疫系统和神经系统等产生不利影响，减少DINP暴露对于降低上述系统疾病发病率具有重要意义。目前有关DINP毒性及其机理的研究存在以下问题。(1)DINP是生活用品中常见的添加物，因生殖毒性等毒性作用显著低于DEHP和DBP等被认为是安全的；虽然DINP生物半减期短、短时间内低剂量接触对机体无明显的不利健康影响，但长期接触使用含有DINP的物品可能对机体健康造成潜在风险。(2)与DEHP等邻苯二甲酸酯类物质相比，DINP相关的体内、外研究较少，并且缺乏人群暴露控制实验研究；加强DINP重复暴露及重复健康随访之间关系的纵向研究，可能为DINP暴露对人体健康(如心血管健康等)的影响提供有力证据。(3)DINP暴露所致有害作用的最低剂量和安全限值尚未确定，尤其婴幼儿产品及职业环境中DINP的安全限值亟待确定。(4)DINP是否具有特殊毒性作用目前尚无报道。因此，有必要针对DINP的毒作用及机理开展进一步动物实验研究及人群流行病学研究，建立健全DINP环境暴露相关卫生标准，为DINP相关疾病的防治提供更多的科学证据。

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