壮药解酒方对酒精性肝病大鼠肝损伤的保护作用

符颖欣，黄光临，林泉志，梁淇棋，覃婕，马卓飞*

(1.右江民族医学院，广西 百色 533000；2.那坡县中医医院，广西 百色 533900)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是因长期过量饮酒导致的肝细胞结构异常和(或)功能障碍性疾病[1]，相关研究表明造成ALD的主要原因是由于酒精代谢所产生的氧化反应和炎症反应促使肝细胞坏死、脂肪蓄积、肝纤维化、肝硬化等病变[2]。随着社会经济的发展，饮酒的人群数量不断增多，ALD的发病率不断升高，已成为我国继病毒性肝炎之后的第二大肝病[3]。目前西医治疗ALD方式单一，仅限于戒酒治疗、对症治疗、营养支持和肝移植等[4]。在壮医理论中，机体毒、虚会导致各种疾病的发生，人体正气虚衰，毒邪侵袭，藏伏咪叠(肝)，蕴生诸毒，嘘勒(气血)瘀滞，致“三道两路”不通而为肝病。治疗上应以祛邪排毒、补益正气、疏通道路为主。本实验通过建立大鼠ALD模型，检测大鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TRIG)的含量，以及肝组织中丙二醛(MDA)的含量、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性，肝指数及肝组织形态学改变等方面，研究并探讨壮药解酒方对酒精性肝病大鼠肝损伤保护作用及其作用机制，为酒精性肝病的防治及壮药解酒方开发和应用提供依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SD清洁级大鼠70只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由右江民族医学院动物实验中心提供(许可证号：SCXK桂2017-0004)。

1.2 实验药物及试剂

党参、柴胡、丹参、白芍、葛花等购自广西大参林连锁药店有限公司，岩黄连由那坡县中医医院提供，经覃道光副教授(右江民族医学院民族医学门诊部)鉴定为正品。美他多辛胶囊(浙江震元制药有限公司，生产批号：H20052458)。56°红星二锅头酒(北京红星股份有限公司，生产批号：20180402)。考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20180615)、超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20181116)、谷胱甘肽过-氧化物酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20181122)、丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20181121)。

1.3 壮药解酒方水提取物的制备

将党参30 g、柴胡10 g、岩黄连10 g、丹参10 g、白芍30 g、葛花20 g清洗后充分浸泡，煎煮2 h，过滤。再加入水煎煮，将2次药液混合浓缩至浓度 5 g·mL-1，分装备用，冰箱4 ℃保存。使用前以无菌蒸馏水按所需浓度配制成水溶液，在37 ℃水浴，摇匀。

1.4 主要仪器

日立7600全自动生化分析仪(株式会社日立高新技术公司)；JM-B1003型电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司)；HH-W600型恒温水箱(金坛市医疗仪器厂)；TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)；722型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 造模及分组

70只大鼠分开适应性饲养5日，从雌雄两组中随机分组(每组14只)：正常组、模型组、美他多辛组(9 mg·kg-1·d-1美他多辛)、壮药解酒方低剂量组(2.5 g·kg-1·d-1)、壮药解酒方高剂量组(5 g·kg-1·d-1)。每日予正常组和模型组0.9%生理盐水灌胃，美他多辛组及壮药低、高剂量组予相应药物灌胃；2 h后，除正常组予0.9%生理盐水灌胃外，其余各组按10 mL·kg-1给予56°二锅头酒灌胃，共56天。

2.2 标本采集

第56天末次给药后12 h，称量每只大鼠体质量，7%水合氯醛进行麻醉，腹主动脉取血，制备血清，分离完整肝脏组织备用，处死。

2.3 指标检测

2.3.1 肝指数 用4 ℃无菌0.9%生理盐水将剥离的完整肝脏组织表面血迹冲洗干净，后用滤纸将水分吸干，称重，计算肝指数(公式：肝指数%=肝湿重÷末次大鼠体重×100%)。

2.3.2 血清肝功能 所采集的大鼠血液标本送至右江民族医学院附属医院检验科，使用日立7600全自动生化分析仪测量血清ALT、AST活性和CHOL、TRIG含量。

2.3.3 肝组织SOD、MDA、GSH-Px的测定 取部分肝组织，迅速用4 ℃ 0.9%生理盐水冲洗肝脏表面，分装至高压灭菌无酶的EP管，置于-80 ℃保存备用。将保存于-80 ℃的肝组织按1∶9加入4 ℃ 0.9%生理盐水机械匀浆，将组织匀浆离心10 min，3 000 r·min-1，取上清液制成10%组织匀浆。按各试剂盒说明书操作，用722型可见分光光度计检测各项指标的分光光度值(MDA、SOD、GSH-Px、考马斯亮兰测量肝组织蛋白质浓度比色测定波长分别为532 nm、550 nm、412 nm、595 nm)。

2.3.4 肝组织形态学制片 切取中间部肥厚的肝组织，用15%甲醛溶液固定，制作病理切片(方法：梯度酒精脱水→二甲苯透明→恒温箱透蜡→石蜡中包埋→石蜡块的固定和整修→切片机上切片→水上捞片→烘干切片→HE染色→二甲苯透明→胶水贴片→树胶封片)，使用数码显微镜观察并拍摄各肝组织切片在形态学上的变化。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 对大鼠肝指数和体质量的影响

实验期间，正常组大鼠皮毛顺滑，动作敏捷，精力充沛，脾性温顺；模型组大鼠皮毛蓬乱，活动迟缓，嗜睡，脾性躁狂。从表1可见，模型组大鼠的体质量增长值明显低于正常组大鼠(P<0.05)，美他多辛组和壮药各剂量组大鼠体质量增长值高于模型组大鼠(P<0.05)；模型组大鼠的肝指数高于正常组大鼠(P<0.05)，美他多辛组和壮药低、高剂量组大鼠肝指数低于模型组大鼠(P<0.05)，差异具有统计学意义。

表1 壮药解酒方对大鼠肝指数和体质量增长值的影响

3.2 对血清中ALT、AST、CHOL、TRIG水平的影响

从表2可见，模型组大鼠血清中ALT、AST水平明显高于正常组大鼠(P<0.01)，证明模型组大鼠已造成肝损伤，本次造模成功。模型组大鼠血清中ALT、AST水平高于美他多辛组及壮药低、高剂量组(P<0.05，P<0.01)，表明各药物干预组大鼠肝损伤程度低于模型组。正常组大鼠血清中CHOL、TRIG水平高于模型组(P<0.05)，模型组大鼠肝脏内脂质代谢能力减弱，模型组大鼠血清中CHOL、TRIG水平均高于美他多辛组及壮药低、高剂量组(P<0.05，P<0.01)，各药物的干预对酒精性肝病模型大鼠具有降脂作用。其中壮药低剂量组大鼠的血清中ALT、AST水平低于美他多辛组，实验数据差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 壮药解酒方对大鼠血清中ALT、AST、CHOL、TRIG水平的影响

3.3 对肝组织中MDA、SOD及GSH-Px的影响

从表3可见，模型组大鼠肝组织中MDA水平高于正常组大鼠，SOD及GSH-Px活性低于正常组大鼠(P<0.05)；美他多辛组及壮药低、高剂量组肝组织中MDA水平低于模型组大鼠，SOD及GSH-Px活性高于模型组大鼠(P<0.05，P<0.01)，其中壮药低剂量组和模型组大鼠肝组织中SOD活性(P>0.05)，差异不具统计学意义。

表3 壮药解酒方对酒精性大鼠肝组织中MDA含量、SOD及GSH-Px活性的影响

3.4 对大鼠肝组织的影响

3.4.1 大鼠肝组织肉眼观 正常组大鼠肝脏呈暗红色，表面光滑有光泽，质地软。模型组肝脏颜色黄褐色，个别可见黄色结节，表面紧致无光泽，质地软。美他多辛组及壮药低、高剂量组肝脏大体相似，颜色稍粉红，表面尚有光泽，质地软。

3.4.2 大鼠肝组织形态学改变 由图1可见，正常组肝小叶结构清晰，辐射状肝索排列整齐，无变性坏死及中性粒细胞浸润。模型组肝小叶结构已破坏，肝索间排列混乱，大量肝细胞坏死、脂肪样变性，可见空泡脂滴、气球样变，中性粒细胞浸润；美他多辛组及壮药低、高剂量组肝组织形态大体相似，相较于模型组辐射状肝索排列破坏减轻，可见空泡脂滴、气球样变比例大大降低，中性粒细胞浸润明显减少。

A.正常组；B-C.酒精性肝病模型组；D.美他多辛组；E.壮药低剂量组；F.壮药高剂量组

4 讨论

酒精性肝损伤的形成基础是长期大量的摄入酒精，乙醇及其代谢产物在机体中消耗大量抗氧化因子[4]，当机体内氧化物大量积累、肝细胞无法及时清除时，则会导致肝细胞膜发生脂质过氧化反应[5]，引起肝细胞炎症，出现肿胀、脂肪变性、炎细胞浸润，甚至出现肝细胞的坏死[6]。变性坏死的肝细胞会使细胞膜的通透性增加，使血清中ALT、AST含量升高，故通过检测血清中ALT和AST含量可作为肝损伤诊断依据[3]。大量乙醇在机体中脱氢氧化为乙醛和乙酸盐，使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱，从而影响机体脂肪代谢[7]，进一步导致血清中CHOL、TRIG升高。本实验结果表明，壮药解酒方能降低ALD大鼠血清中ALT、AST水平，对肝脏损伤具有一定的保护作用；血清中CHOL、TRIG水平下降，表明壮药解酒方能调节机体脂肪代谢，防止甘油三酯在肝细胞中大量堆积。

氧化应激是酒精性肝病发生的重要机制之一，MDA作为脂质过氧化反应的主要终产物，MDA的含量能直接反映机体脂质过氧化损伤的程度[8]；而SOD为体内超氧化物阴离子清除剂，GSH-Px可以清除脂质过氧化物，对肝损伤具有保护作用，SOD活性和GSH-Px含量的高低可以反映机体抗氧化能力的强弱[9]。本实验中，壮药解酒方能显著降低肝脏中MDA含量，升高ALD大鼠肝组织中GSH-Px、SOD水平，对酒精性肝病肝细胞损伤具有保护作用；其机制可能是与增强体内抗脂质过氧化和清除氧自由基的能力相关。

壮医认为肝病的发生是由于人体正气不足，毒邪侵袭，藏伏咪叠(肝)，蕴生诸毒，嘘勒瘀滞，致“三道两路”不通。壮药解酒方是那坡县中医医院肝病科在民间验方的基础上经多年临床实践研发而成，方中主要成分岩黄连为广西壮族地区常用壮药，性味苦寒，具有疏通调节两路、调和谷道、清瘀毒的作用；葛花善解酒毒；柴胡、白芍疏肝解郁；丹参活血化瘀。全方合用具有祛邪排毒、补益正气、疏通道路之功效，故而对于酒精性肝病有一定的治疗作用。

综上所述，壮药解酒方在一定程度上能保护ALD大鼠肝细胞的形态结构及功能、减轻乙醇所致的肝损伤，其作用机制可能与维持机体抗氧化平衡有关。本研究为壮药解酒方的进一步研究、开发和应用提供了实验依据。