特异性短串联重复序列位点检测在遗传病产前诊断中的应用▲

刘晓丽 钟青燕 罗世强 王秋华 许泽辉 覃柳群 王敬仁 陈丽竹 唐 宁

(广西柳州市妇幼保健院医学遗传科，柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，柳州市 545001，电子邮箱：1027609273@qq.com)

临床上，在遗传病产前诊断时，有时在穿刺过程中羊水和绒毛标本可混有母亲血液成分，从而使产前诊断样本受到母血污染，即母源成分污染，导致产前诊断结果不准确而引发严重后果[1]。21-三体综合征和性染色体多倍体综合征分别是临床上最常见的常染色体疾病和性染色体疾病。目前，细胞核型分析是诊断染色体病的金标准，但该方法烦琐、检测周期长[2]，因此建立准确、快速的产前诊断技术已势在必行。短串联重复序列(short tandem repeats,STR)是目前理想的遗传标记。有学者针对200名韩国人染色体进行分析，发现在该人群的21号染色体上STR基因座D21S1435、D21S1411和D21S1412具有较高的异质性和多态性[3]。而在中国东南地区汉族人群中21号染色体上的11个STR位点均表现出较高的多态性和异质性，其中D21S1412、D21S1270、D21S11和D21S1442的异质性相对较高[4-5]。目前 DXS1053、DXS981、DXS6809、DXS1187、DXS8377和X22等位点的检测已被运用于性染色体非整倍性的快速诊断中[6]。本文选取性染色体上DXS6809、DXS981、X22和21号染色体上D21S1435、D21S11、D21S1411及AMXY基因作为个体识别标志,采用PCR-STR复合扩增检测技术，探讨这些特异性STR位点检测用于遗传病产前诊断及判断地中海贫血产前诊断样本是否存在母源成分污染的可行性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2019年10月在柳州市妇幼保健院产前诊断中心就诊，存在生育中、重型地中海贫血胎儿风险的3 587例孕妇作为研究对象。其中孕妇年龄19～42(31.0±4.2)岁，接受产前诊断时的孕周为12+1～22+5周。所有研究对象均自愿接受地中海贫血基因产前诊断检测。

1.2 检测方法

1.2.1 样本采集：遵循无菌操作原则，在超声仪定位及引导下对1 614例孕12～14周的孕妇行绒毛组织的采样，置于两支无菌的离心管中；对1 973例孕16～22周的孕妇(孕15周孕妇均等到孕16周后进行羊膜腔穿刺)进行羊膜腔穿刺，抽取羊水20 mL，置于两支无菌的离心管中。利用真空负压法，抽取所有孕妇的外周静脉血3～5 mL，置于含乙二胺回乙酸抗凝管。

1.2.2 DNA提取：采用酚氯仿法[7]提取适量的绒毛或羊水细胞的DNA，Lad-Aid 820自动核酸提取仪(厦门致善生物科技股份有限公司 )提取孕妇全血基因组DNA。采用ASP-2680核酸分析仪(美国ACTGene公司)检测DNA浓度纯度，待检基因组DNA的浓度在2～200 ng/μL之间，纯度(A260/A280)在1.7～2.0之间。

1.2.3 STR位点检测：利用荧光PCR毛细管电泳法检测21号染色体及性染色体上特异性STR位点(D21S1435、D21S11、D21S1411、DXS6809、DXS981、X22)和一个性别基因(AMXY)。(1)扩增特定的DNA片段。取羊水或绒毛以及孕妇外周血的基因组DNA，采用21-三体综合征和性染色体多倍体检测试剂盒(中山达安基因公司，批号：2019003)进行检测，每次实验需做1个阴性对照、1个21-三体阳性对照、1个性染色体多倍体阳性对照。各取胎儿及母亲DNA 1 μL加入24 μL PCR混合液，PCR混合液组分包括PCR反应缓冲液16 μL、引物混合物4 μL、Taq酶0.5 μL和水3.5 μL。混匀后在ABI 9700 PCR仪(厂家：ABI公司)上扩增。扩增条件：93℃预变性3 min；93℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，共26个循环；最后60℃ 60 min。(2)毛细管电泳检测。取PCR产物，95℃变性5 min，冰浴3 min后置于3 500 Dx型遗传分析仪(美国ABI公司)上进行毛细管电泳分离，用GeneMapper®ID-X.Ink数据收集软件(美国ABI公司)、GeneMapper®ID-X.Ink基因扫描软件(美国ABI公司)计算各核苷酸片段的峰高和峰面积等。不同位点荧光峰值面积比值的判断参照欧盟临床细胞遗传学和分子遗传学协会年会关于应用荧光定量PCR方法诊断非整倍体染色体病的实验指南[8]。

1.2.4 地中海贫血基因分析：取羊水或绒毛以及孕妇外周血的基因组DNA，采用裂口PCR法检测缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因，反向斑点杂交法检测非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因以及β-珠蛋白生成障碍性贫血突变型基因，具体方法步骤详见试剂盒说明书(深圳益生堂生物企业有限公司，批号：20190301)。

1.2.5 核型G显带分析：取适量的绒毛或羊水标本，两线独立无菌接种培养，消化法常规收获绒毛或羊水细胞后行G显带分析。每例两线细胞共计数至少20个细胞中期分裂相，对其中至少6个进行核型分析。

2 结 果

2.1 产前诊断样本母源成分污染情况及地中海贫血检测结果 1 973例羊水和1 614例绒毛样本中共检测到6例存在母源污染成分，其中3例原标本中重新提取DNA，另3例从核型分析留存的羊水贴壁细胞中重新提取DNA，检测结果均提示无母源污染。编号为CR7456的胎儿及其母亲(编号M7456)的STR位点检测结果显示，母亲的各STR产物长度与胎儿的各STR产物长度一致(如图1A和图1B)，即胎儿绒毛有母源成分；在原标本中重新提取胎儿绒毛DNA进行实验，结果显示胎儿的AMXY、DXS6809、DXS981产物长度与母亲的AMXY、DXS6809、DXS981产物长度不一致(如图1C)，即无母源污染。6例母源成分污染羊水或绒毛DNA，以及在原绒毛标本或羊水贴壁细胞中重新提取的DNA的地中海贫血基因检测结果见表1。

图1 母源成分污染结果图

表1 6例母源成分污染羊水或绒毛样本的地中海贫血基因检测结果

2.2 STR检测与染色体核型分析对21-三体的检出情况 采用特异性STR位点检测和染色体核型分析技术对1 973例羊水和1 614例绒毛进行检测，均检出21-三体胎儿2例(羊水、绒毛标本各1例)，两种方法检出的结果一致。

2.3 STR检测与染色体核型分析对X染色体嵌合体的检出情况 根据遗传定律，胎儿的遗传物质一半来自父亲，一半来自母亲。1例绒毛样本的X染色体上的同1个STR位点峰值面积不一致，如图2A中a区域蓝色荧光波峰(性别基因AMXY位点)只有1条，说明胎儿是女性；其他3个b、c、d区域蓝色荧光波两组峰值面积比为1 ∶2或者2 ∶1，即X染色体DXS6809、DXS981、X22位点出现两个等位基因峰含量不平衡，提示可能存在(45，X)/(46，XX)嵌合体、X三体核型等情况。召回孕妇，抽提羊水进行染色体核型分析验证，分析的50个染色体核型中有1个(45，X)，其余核型为(46，XX)。

图2 (45，X)、(46，XX)嵌合体核型

3 讨 论

地中海贫血，又称珠蛋白合成障碍性贫血，是广东、广西、海南、云南、贵州等地区发病率最高的一种单基因遗传病[9]。目前对于地中海贫血的治疗主要有定期输血、干细胞移植治疗，但费用昂贵，因此地中海贫血产前诊断是预防重度和极重度地中海贫血患儿出生的重要手段。在羊膜腔穿刺过程中，穿刺针通过孕妇腹壁层、子宫层及羊膜腔时携带微量的孕妇组织；绒毛穿刺时不慎抽到蜕膜组织或在显微镜下去除蜕膜不干净或直接把蜕膜当作绒毛[10-11]，这些均可导致所提取出来的DNA部分或全部含有母亲的DNA，使得产前诊断的结果不准确。本研究通过检测STR位点发现了6例地中海贫血产前诊断标本存在母体成分污染，其中3例绒毛样本在原标本中重新提取DNA，3例羊水标本从羊水贴壁细胞中提取DNA后进行实验均提示无母源污染；重新抽提的样本中，有2例检测出地中海贫血基因型为--SEA/--SEA，即为水肿胎，及时对孕妇进行引产，避免了对孕晚期孕妇的生命造成危害。因此STR位点检测可以有效地鉴别产前诊断样本的母源成分，是地中海贫血产前诊断的必要补充。据了解,目前有些地区已采用STR位点检测来排除穿刺造成的母体组织污染[12]。有些地区采取的措施是丢弃最初2 mL羊水[13]，但并未进行STR位点的检测，因此最初2 mL羊水是否已全部排除母体细胞还有待考究。

染色体病即染色体异常，主要是染色体数目或结构异常而引发的疾病。临床上常见的常染色体异常主要有21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征和13-三体综合征。何薇等[14-15]报告应用荧光定量PCR法进行产前诊断，即检测21号染色体STR位点,可有效判断胎儿是否为21-三体，检出率达91%以上，且与细胞核型分析结果一致。本研究通过PCR-STR法对21-三体进行检测，检出结果亦与染色体核型分析结果一致。但本研究仅对21号染色体和性染色体的STR位点进行检测，后续将增加13号染色体和18号染色体STR位点的检测，从而排除临床上常见的常染色体异常。STR还可以提示性染色体数目是否异常，从而判断单亲二倍体、性染色体嵌合以及X三体等情况。本研究中，PCR-STR法检出1例孕妇的绒毛组织(45，X)、(46，XX)嵌合体核型比例与羊水染色体嵌合核型比例不一致，这可能与胚胎发育过程中发生的改变有关。研究表明，绒毛膜主要是由胚外中胚层和滋养层组成，与胎儿组织有同源性；而羊水细胞为胎儿体表、泌尿道、呼吸道、消化道等脱落的细胞，来源于外胚层、中胚层和内胚层；在胚胎发育的过程中，染色体变异可以发生在不同胚层的分化过程中，如果变异只发生在外胚层或内胚层，就会出现羊水核型与绒毛核型不一致的现象[16-17]。而染色体核型分析如何鉴别真假嵌合体以及判断嵌合体的风险是细胞遗传学工作者面临的一个问题，同时也是医生进行遗传咨询时难以决定胎儿去留的难题。因此， 应严格按照技术规范与指南进行产前诊断项目的检测，并采用多种方法相互验证。

产前诊断羊水或绒毛样本是否存在母体细胞直接影响产前诊断结果的准确性,母体细胞污染导致产前诊断结果的误诊可危害孕妇的生命健康。特异性STR位点检测可用于鉴别产前诊断样本是否存在母体细胞，同时其还可检测出21-三体及性染色体数目异常，在快速产前诊断中具有重要的意义。