脉冲电场导致囊泡成孔作用机制的研究进展

石铭芸，蒋中英

(伊犁师范大学电子与信息工程学院 微纳电传感器技术与仿生器械实验室，新疆 伊宁 835000)

电场与生物工程相结合可产生高效、有益的现象，例如改变细胞信号转导、促进伤口愈合和细胞生长、诱导外源分子跨膜输运等。若将生物细胞或组织暴露于脉冲电场中，可导致细胞膜的结构发生改变，并增强其导电性或渗透性。研究者成功开发了最小细胞膜系统模型——囊泡，该模型可以更好地解释细胞膜的多种响应机理。目前，对细胞生物学的大部分理解都是基于这一简单模型的研究[1]。囊泡的大小从几十纳米到几十微米不等。囊泡由于组分及其溶液环境存在差异而呈现出不同的电特性，因此，在电场中可以对囊泡进行精准控制。囊泡在强脉冲电场作用下，脂质双分子层形成瞬时孔隙，脂质膜的通透性显著提高[2]，这种现象被称为电穿孔或电渗透。作者主要以巨型单层囊泡(giant unilamellar vesicles，GUVs)暴露于脉冲电场为例，简要介绍电穿孔技术的发展历程，主要综述脉冲电场导致囊泡成孔的作用机制，并展望未来的发展趋势。

1 电穿孔技术的发展历程

1965年，Coster[3]在进行单细胞的电特性研究时，首次提出穿透效应这一概念。1977年，Zimmermann等[4]发现，巨藻细胞在外加压力下，临界击穿电位会随外加压力的增加而相应降低，说明电场作用下的囊泡具有电场击穿效应[5]。1996年，Weaver等[6]研究发现，当施加电场强度为kV·cm-1量级、持续时间约为微秒至毫秒量级的电脉冲刺激细胞时，脂质双分子层会出现孔隙，其电导率发生改变[7]。自2012年以来，一些科学家如Lee等[8]、Geng等[9]、Casciola等[10]给出了个案的经验性指导，包括重要的电场控制参数的设置等。2017年，de Figueiredo等[11]从理论上分析了外部电场对脂质分子和其结构性质的影响。2020年，Karal等[12]讨论了胆固醇对GUVs电穿孔的影响。因此，可以认为GUVs的电穿孔行为强烈依赖于脂质分子的结构。

国内关于细胞电穿孔现象的研究也基于细胞模型揭示了脂质膜的多种响应机理，并得出了一般规律。1994年，刘缨等[13]研究表明，电穿孔大小、愈合速率与电脉冲参数有关。2006年，张弘[14]指出，施加的脉冲幅度是影响电穿孔的主要因素。2012年，谈亚芳[15]定量分析了肿瘤细胞外膜、内膜电穿孔效应的波形参数条件，得到脂质膜发生电穿孔的电脉冲波形参数阈值条件。2016年，Liu 等[16]研究表明，脂质膜的电透性与囊泡脂质双层膜的组分直接相关。2017年，Rao等[17]采用微流控电穿孔技术促进红细胞膜磁性纳米粒子的合成。2020年，姚陈果等[18]深入研究了微/纳秒脉冲电场诱导电穿孔时细胞物理特性的差异。电穿孔技术在生物医学领域得到了广泛的应用，并为癌症的诊断和治疗提供了更具体的数据参考和理论支撑。虽然电穿孔技术应用广泛，但关于外场作用下的脂质膜形成孔隙和再组装的动力学过程及调控因素的研究仍较少。因此，深入开展该领域的研究有助于更好地实现电场对生物细胞及组织组装行为的调控。

2 脉冲电场下囊泡成孔的作用机制

2.1 感应跨膜电压

脂质双分子层的两亲性结构使离子无法渗透脂质膜，其疏水层在外电场中呈弱极性。相较于周围的水溶液，脂质膜可以看作是一层薄的介电层，如果将该模型暴露于强直流电场环境中，可以观察到电穿孔现象。脉冲电场作用下，囊泡如独立的球体悬浮在均匀的直流电场中(图1)。电场驱动内部和外部溶液中的带电离子，使脂质膜像电容器一样带电，通过膜电荷e积累形成感应跨膜电压Um。根据H.P.Schwan方程[16]，电场强度E增大时，Um随时间t延长而增加。

Um=1.5ERcosθ(1-e-t/tchg)

(1)

图1 暴露在电脉冲下的囊泡示意图Fig.1 Schematic diagram of vesicles exposed to electrical pulse

其中，感应跨膜电压Um与囊泡半径R成正比，随脂质膜上电场方向与指定点法线之间的夹角θ而变化；tchg为电荷在电场作用下脂质双分子层上累计的时间，它与膜电容Cm和脂质双分子层内部溶液电导率λi及外部溶液电导率λe有关，可以表示为：

(2)

如果囊泡在电场中脉冲的持续时间长于充电时间，Um达到稳态，即：

Um=1.5ERcosθ

(3)

随着外加电场强度增大，脂质膜上的膜电压也随之增加，当Um=Ucr，囊泡将出现电穿孔现象，此时诱导膜电压Ucr为跨膜临界(阈值)电压。为了确定变形或电穿孔时囊泡上的Um，通常需要使用数值计算。方程式(1)(3)仅适用于球形和未变形的囊泡，只能给出参考值。在实际中，需要考虑多种因素的影响，例如：囊泡大部分是不规则的球形；不同的囊泡其脂质膜组分也不同；不同的培养条件以及不同的溶液成分造成生理环境存在差异，进而对电穿孔有不同程度的影响。

2.2 脂质膜上孔隙的形成

在没有电场的情况下，脂质膜的稳定性基于两种相互竞争的能量，即：

E=2πaΓ-πa2τ

(4)

式中：第一项表示切割分子间相互作用所需要的能量以及建立半径为a的柱形孔隙边缘所需要的能量，用线张力Γ表示；第二项为在膜张力τ作用下通过释放孔膜面积所获得的能量。在这两种能量的相互作用下产生了孔隙的临界半径，脂质膜上的孔隙若超过该临界半径，囊泡发生不可逆破裂。

孔隙的形成改变了边界条件，增强了电场效应，根据Helfrich理论模型，当施加电场后，电场下孔隙的成长方程式[19]为：

(5)

式中：Eproe为影响脂质膜成孔的电场强度；d为膜厚度；ε0为真空介电常数；εW为水的相对介电常数；ε1为脂质相对介电常数；V0为外加电压。

当跨膜的外加电压V0增加时，导致Γeff=0或τeff=0(Γeff和τeff为电场加入后的有效值，Γ和τ为理想参数)。当Γeff=0时，V0的增加导致临界半径减小并促使囊泡破裂；反之，当τeff=0时，V0的增加使脂质膜上形成稳定的孔隙。电导率导致孔隙周围的电场线显著变形；若孔隙半径a过大，膜厚度d可忽略不计(图2)。

2.3 脂质膜的不稳定性

囊泡的脂质膜可看作是一个自放电式的电容，在脉冲电场的作用下，脂质膜的充放电时间是非常重要的参数。肖华娟等[5]研究了电穿孔与电脉的关系，结果表明，脂质膜的成孔率随电场强度、脉冲个数或脉冲宽度的增加而提高(图3)。Mauroy等[20]

图2 孔隙形成后脂质膜在外部电场中的示意图Fig.2 Schematic diagram of lipid membrane after pore formation in external electric field

图3 脉冲强度(a)、脉冲个数(b)、脉冲宽度(c、d)对脂质膜成孔率的影响Fig.3 Effect of pulse intensity(a),pulse number(b),and pulse width(c,d) on pore formation probability of lipid membrane

冲参数之间也证实了脂质损失是由电场中脉冲的持续时间所控制。Dimova等[21]进一步研究了外加交流电场的频率和囊泡内、外部水溶液电导率的比值(χ=λi/λe)，发现囊泡可以变形成长椭球体(χ>1)或扁椭球体(χ<1)。通过在交流电场中测量囊泡的电变形，可以得到脂质膜的相关机械性能，如抗弯刚度、电性能和电容等。Riske等[22]利用相差显微镜和高速数码相机研究了GUVs在50～300 μs脉冲下的电变形，发现了类似的GUVs变形对电导率比值χ的依赖关系，并强调了离子在外部溶液中的影响。在无离子存在的情况下，GUVs变形成长椭球体；加入离子后，GUVs瞬间变形成特殊的圆柱形，同样取决于电导率比值χ(图4a)。此外，他们通过测定变形的GUVs长宽比a/b来确定变形的程度(图4c)。结果表明，变形程度随电场强度的增加或脉冲持续时间的延长而提高，同时也取决于GUVs的初始张力。关于脉冲电场诱导不规则形状细胞的电穿孔行为，Mescia等[23]又提出了一种数值算法，并根据不同实验案例分析了电穿孔过程中细胞类型、形状对电穿孔特性的影响。结果表明，该模型是研究任意形状细胞电穿孔问题的有效数值工具。值得注意的是，GUVs在电场脉冲过程中的变形是动态的，并取决于脉冲持续时间、电场强度、χ以及外部溶液中存在的离子等。

a.在200 s、2 kV·cm-1的脉冲作用下，χ=1.38、λi=16.5 μs·cm-1、λe=12 μs·cm-1时GUVs呈管状变形

综上所述，通过对脉冲反馈信号测量结果的分析可进一步了解脉冲电场与脂质膜相互作用机制，从而更加准确地模拟细胞在脉冲电场作用下的动态行为，为进一步推进脉冲电场的应用提供理论依据，同时也建议通过此反馈信号来建立电穿孔效果实时评估体系。

2.4 脂质膜的组分

囊泡的使用对于控制其脂质膜的组分具有显著的优势，改变膜组分可调整膜的流动性和均一性，并获得特定外场作用下孔隙的尺寸和提高孔隙的稳定性。Dimova等[24]发现，强电脉冲可诱导电中性磷脂酰胆碱(PC)囊泡成孔，并在脉冲结束后该孔隙又重新封闭，其中导致电穿孔的脉冲电压是跨膜临界电压的数倍以上，而负电荷磷脂酰甘油(PG)囊泡则在强脉冲作用下出现破裂、崩解或出芽等现象。Gurtovenko等[25]研究显示，与1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱 (POPC)囊泡相比，1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)囊泡双分子层的临界电压更高。分析表明，POPE比POPC的密度更大，阻碍了水分子在双分子层中的渗透，并减缓了脂质头部基团进入孔隙的重新定向过程。Riske等[26]研究发现，当PC与PG按1∶1的比例组成的负电荷GUVs暴露在电脉冲下时，可观察到一种爆破效应(图5)。

此外，胆固醇的添加也可以降低或提高电穿孔临界电压。Mauroy等[27]研究表明，POPC囊泡上胆固醇浓度的增大会导致临界电压升高，而该胆固醇对PC囊泡的临界电压没有显著影响。Karal等[12]研究发现，随着二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇混合GUVs膜中胆固醇浓度的增大，在外加电场作用下脂质膜的成孔率和成孔速率常数降低(图6)。表明在电场作用下，GUVs膜的线张力随胆固醇浓度增大而增大，是造成成孔速率常数减小的主要原因。总的来说，胆固醇对脂质双分子层的影响是不同的，并且强烈依赖于脂质分子的结构。因此，可以根据不同脂质膜组分优化其电化学参数，这对细胞的生物学意义也有着重要的影响[28]。

a.脉冲参数：1.4 kV·cm-1,tpulse=200 μs

3 结语

目前，电穿孔技术已广泛应用于生物技术、生物医学及遗传工程等多个领域，在电脉冲结合抗癌药物加速肿瘤细胞消亡的研究、遗传物质的电转染技术、非热效应杀菌、经皮给药[29]、抑制基因表达等方面都具有巨大的潜在应用价值。但是电穿孔技术在应用中对部分细胞特性的分析并不是十分完善，特别是在如何由更复杂的GUVs系统来阐明活细胞膜成孔时的作用机制等方面仍然面临很大的挑战。

图6 单个GUVs的孔隙形成的荧光图像(a)、GUVs的随机孔隙形成时间(b)、不同胆固醇(chol)组分GUVs的线张力(Γ)与GUVs在时长60 s内成孔率(Ppore)的关系(c)、添加15%胆固醇的GUVs在Γ为7 mN·m-1、8 mN·m-1和9 mN·m-1时的时间历程(d)Fig.6 Fluorescence images of pore formation of single GUVs(a),random pore formation time of GUVs(b),relationship between thread tension(Γ) of GUVs with different cholesterol components and pore formation probability(Ppore) of GUVs in 60 s(c),and time course of GUVs with 15% cholesterol at Γ=7 mN·m-1,8 mN·m-1，and 9 mN·m-1(d)

今后，脂质膜成孔级联过程重新打开孔隙的所需时间与一般脂质膜系统所需时间的数量级比较及原因探究，将是未来的努力研究方向；膜蛋白在受到电场作用时，影响细胞膜通透性改变的成因分析也将是未来的研究重点。展望未来，还将开辟一个领域，即利用电场作为一种非接触式诊断工具来测量细胞机械性能的变化，并区分与疾病进展相关的重要生物学因素(如病理、遗传和表观遗传等)。