基于网络药理学的抗骨痹方治疗多发性骨髓瘤的作用机制研究

张林 谢颖 李鑫 陈洪雨

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）[1-2]是由骨髓中终末分化的浆细胞克隆扩增所引起的血液恶性肿瘤，可导致体内多器官发生损害，患者最终出现骨痛、骨质破坏、肾功能不全、高钙血症以及造血功能抑制所致的贫血、易感染等一系列临床表现。MM中医属“骨痹”、“虚劳”、“骨蚀”等范畴。大量临床实验表明，虽然传统方法如化疗等明显提高了治愈率，但仍存在不同程度的不良反应、毒副反应、耐药性及易复发等缺点[3-7]。

抗骨痹方是绍兴市人民医院在祖国传统医学中有关医治“骨痹”、“骨蚀”等疾病过程中总结的自拟方，在临床上疗效明显，该方与传统的化疗方案对比有一定的优势，组方中主要的4味中药为白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇和蚤休。其中白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、增强免疫的作用；半枝莲除清热解毒和抗炎作用外，还被广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗；山慈菇具有清热解毒，消痈散结等功效；蚤休可治痈肿、肺痨久咳、跌打损伤、蛇虫咬伤、淋巴结核、骨髓炎等疾病，近年来发现其有抗癌功效。本研究拟采用网络药理学[8]的方法研究抗骨痹方中主要4味中药在治疗MM中的主要靶点和通路，以期为未来深入研究并验证其相关机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 活性成分筛选和靶点预测 通过中药系统药理数据库及分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）对白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇、蚤休的化学成分进行收集。基于TCMSP数据库中的吸收、分布、代谢和排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）参数进行筛选（筛选规则：口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18），筛选出活性成分。获得大量的活性成分后将化学成分信息在线提交到中药分子机制的生物信息学分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional chinese medicine,BATMAN-TCM） 数据库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），并选择可信度较高的蛋白作为预测靶点（Score cutoff＞20）。将检索得到的靶点使用Uniprot数据库转化为统一名称。经上述操作后获得与活性成分相关的靶点信息。

1.2 MM相关基因收集 通过DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/）收集MM相关基因。

1.3 网络构建和分析 将4种单味药的活性成分作用靶点与疾病相关靶点做映射，得到两者共同作用靶点。采用Cytoscape软件构建：（1）成分-靶点网络，如果某一蛋白是化合物作用的靶点，则它们之间进行网络连接；（2）使用互作基因/蛋白质检索的搜索工具数据库（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING）（https://string-db.org/） 构建靶点的蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interactions,PPI）。

1.4 PPI网络的分析 将PPI网络进行网络拓扑结构分析和聚类分析。网络拓扑结构分析运用Cytoscape软件中的工具Network Analyzer来计算自由度degree和介数（Edge Betweenness）这两个重要的网络拓扑参数，并设定拓扑参数的阈值从PPI网络中筛选出Hub基因。网络聚类分析使用软件Cytoscape的插件ClusterONE（ClusterONE算法可以主要解决的是蛋白质复合物的类别识别问题，也就是PPI网络中密集子结构的识别问题。ClusterONE算法中，内聚力得分越高则代表了该组蛋白质越有可能是一种蛋白质复合物）来处理。

1.5 通路富集分析 采用Cytoscape插件ClueGO对Hub基因进行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析（设定阈值 P＜0.05）。

2 结果

2.1 抗骨痹方活性成分以及靶点信息的筛选结果 通过TCMSP和BATMAN数据库获得白花蛇舌草的活性成分有7个，半枝莲29个，山慈菇3个，蚤休4个，见表1。

表1 抗骨痹方活性成分的信息

2.2 成分-靶点网络图和PPI网络图的构建 将获得的抗骨痹方主要成分的活性成分和映射得到的靶点信息导入Cytoscape，构建活性成分-靶点网络图（图1、2）。其中棱形节点代表中药的活性成分，圆形节点代表靶点蛋白。其中不同颜色代表节点的自由度（Degree）不同，颜色从黄到红，自由度依次增大。自由度越大，说明节点在网络中的重要程度越大。活性成分-靶点网络图反映了中药成分与靶点蛋白关系的重要性。

将映射得到的靶点蛋白在线输入STRING数据库，构建白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇、蚤休的蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）（图3），不同颜色的圆形节点代表着不同的靶点蛋白，连线表示蛋白与蛋白之间的相互联系。

图1 4味中药的单独成分-靶点网络图（a：白花蛇舌草；b：半枝莲；c：山慈菇；d：蚤休）

图2 4味中药的总成分-靶点网络图

图3 蛋白-蛋白相互作用网络

2.3 网络拓扑和聚类分析 采用Cytoscape中的Network analysis工具对PPI网络进行拓扑结构分析，提交到BATAMN数据库后获得可信度较高（Score cutoff＞20）的蛋白靶点信息，并与疾病靶点映射后得到映射靶点，筛选出Hub基因（自由度＞均值）共12个，见表2。其中自由度最高的是AKT1和PIK3CG，自由度均为19，表示这两者均能与19个蛋白产生相互作用，在整个蛋白网络中起着关键作用。

表2 Hub基因信息

此外采用了ClusterONE算法对PPI网络进行了聚类分析，结果显示size≥3的模块有6类，模块参数见表3。

表3 映射靶点的聚类分析

采用Cytoscape插件ClueGO，对筛选出的Hub基因进行KEGG通路富集（图4、5，插页）分析。结果以基因和通路相联系的网络图以及柱状图呈现4味药治疗MM的作用机制。网络图中，颜色相同的节点表示Kappa Score值相同，带有红色标签的节点为基因，连线表示两者之间有相互作用的关系；柱状图上的数字表示相关基因的个数，横坐标表示的是进行分析的与每个term相关的基因个数占与每个term相关总基因个数的比例，柱状图的左边为每个term的全称，数字表示进行分析的基因与term相关的个数。

图4 KEGG通路富集分析网络图

图5 KEGG通路富集分析柱状图

3 讨论

MM 属中医“骨痹”、“虚劳”、“骨蚀”等范畴。“骨痹”最早见于《素问·长刺节论篇》曰：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹”。骨痹由机体正气不足，卫外不固，外无御邪之能，内乏抗病之力，复因久住湿地，汗出当风、冒雨、涉水，风寒湿之邪内侵于骨，遂成骨痹[9]。因此中医以驱邪活络、缓急止痛为原则来治疗MM。

本研究发现抗骨痹方的主要4味药的关键作用靶点为AKT1、PIK3CG、PTGS2等。AKT1是3个紧密相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，它被称为AKT激酶，参与调节许多生物学过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等[10]。已知AKT1是β-谷甾醇（白花蛇舌草和山慈菇）、豆甾醇（山慈菇）的作用靶点，而甾醇类化合物具有刺激网状内皮系统增生，加强吞噬细胞吞噬癌细胞的能力[11]。谭宁华等[12]采用白花蛇舌草的乙醇提取物对肿瘤细胞株进行了细胞毒活性筛选，发现白花蛇舌草提取物有一定的细胞毒性，并从中分离出了甾醇类化合物。Gabay等[13]研究发现，豆甾醇具有抑制炎症和基质降解的作用，可通过阻碍1L-1β诱导的NF-κB通路来发挥作用。PIK3CG（磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸-3-激酶）参与磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）的合成，PIP3在激活细胞生长、存活、增殖、运动和形态的信号级联等方面起着关键的作用。本研究已筛选出PIK3CG是槲皮素（白花蛇舌草）的关键作用靶点。槲皮素的药理研究中对多种恶性肿瘤细胞均有抑制生长的作用，包括胃癌细胞[14-15]、肝癌细胞[16]、乳腺癌细胞[17]等。PTGS2又称前列腺素内过氧化物合酶2（COX2），负责合成重要的生物激素——前列腺素家族的介导物质。PTGS2的上调与细胞黏附增加、表型改变有关。据近些年来的流行病学研究，PTGS2在多种肿瘤中普遍存在过度表达的现象。已知PTGS2为对羟基苄基酮（半枝莲）及2-甲氧基-3-甲基蒽-9，10-酮（为白花蛇舌草蒽醌类成分）的作用靶点。目前，关于蒽醌类和芳香酮类化合物抗肿瘤的研究很少，有待进一步的研究。研究者从KEGG通路富集结果中选出3个Term来进行分析，包括细胞凋亡（Apoptosis）、神经营养因子信号通路（Neurotrophin signaling pathway）、慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia）。从STRING数据库的Analysis可得知，白花蛇舌草和山慈菇均存在与这3个Term相关的蛋白靶点，蚤休和半枝莲虽对上述通路无调节作用，但可调节卵巢类固醇激素分泌、花生四烯酸代谢等其它生物过程。细胞凋亡作为可以诱导肿瘤细胞凋亡的一种重要自稳机制[18-20]，一直以来是人们的研究热点。Jiang等[21]研究了白花蛇舌草对人骨髓增生异常综合征细胞系的凋亡诱导作用，发现其可通过激活半胱天冬酶和抑制PI3K/AKT途径来发挥诱导细胞凋亡的作用。神经营养因子包括神经生长因子家族、胶质源性神经生长因子以及其它神经营养因子[22]。目前，关于脑源性神经生长因子（BDNF）对MM疾病机制研究较多[23]。实验证明，BDNF、生长因子以及高亲和力受体原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）有助于MM细胞的生存[24]。血小板是BDNF等生长因子的重要储存场所，已有研究证明血小板促进肿瘤转移机制可能与肿瘤细胞聚集体的形成和聚集体黏附到血管内皮细胞有关[25]。郭一萌[26]观察了槲皮素等对血小板聚集的作用，结果发现槲皮素对血小板的抑制作用最强，抑制率可达（68.33±2.43）%。慢性粒细胞白血病是一种由多能干细胞转化而来，以骨髓粒细胞系统无限制性增生及部分分化为特征的白血病。已有研究证明，槲皮素能诱导人慢性髓系白血病细胞增殖抑制和凋亡，其机制可能是通过抑制JAK2/STAT3信号传导通路实现的[27]，而JAK2/STAT3信号传导通路是MM细胞的重要通路，其活化受到抑制，可强烈诱导MM细胞的凋亡[28]。

本研究采用了多个网络药理学研究分析平台，研究了抗骨痹方主要4味中药的活性成分和靶点，并构建了成分-靶点网络，蛋白-蛋白相互作用网络，同时通过多种方法对关键的蛋白靶点和Hub基因相关通路进行了分析，进一步证实了抗骨痹方是通过AKT1、PIK3CG、PTGS2等多靶点及调控细胞凋亡和神经营养因子信号通路等过程从而发挥多靶点、多通路的抗MM的作用。

本研究为进一步了解抗骨痹方在治疗MM中的作用机制和特点提供了网络药理学证据，为临床上中医药方法治疗骨髓瘤提供了重要的参考依据，也为进一步开发和深入研究该组方奠定了基础。