丹酚酸B纯化工艺自动化控制研究

保红云，孙仁弟，邱明丰

（1.上海交通大学药学院，上海 200000；2.上海绿谷生命园医药有限公司，上海 200000）

丹酚酸B是中药丹参的主要成分，具有抗肿瘤，保护心脑血管等作用。丹酚酸B的富集和纯化主要由大孔吸附树脂纯化工序进行操作，丹酚酸B目前采用手动操作进行富集，难以避免因手动操作控制不准确而引起的产品质量差异。本课题的主要研究内容为：通过建立丹酚酸B纯化工艺自动化生产线，制定纯化过程标准操作规程，严格控制产品纯化过程[1]，提高丹酚酸B纯化工艺批间质量稳定一致性、产品转移率[2]和成品丹酚酸B含量。

1 仪器、试剂与材料

AB135-S电子天平（梅特勒-托利多）；FA1004N型天子天平（上海天平仪器厂）；1200型高效液相色谱仪（安捷伦）。

甲醇为色谱纯；水为纯化水；磷酸为分析纯；丹酚酸B标准品。

2 实验方法

2.1 自控程序

吸附柱是利用D-101大孔吸附树脂的特殊结构，通过D-101大孔吸附树脂巨大的比表面进行物理吸附，用不同的溶剂将吸附物质洗脱下来，从而达到有效成分分离、纯化的目的[3][4]。自控程序是通过控制工序段中各个设备运行的动作并检测记录其状态，综合协调最优化工序段的生产控制参数[5]。严格遵守规范可靠性、技术先进合理性、模块化、开放性和安全性5大原则[6]，保证中药生产工艺的每个参数和具体操作过程得到科学有效地监控，达到中药生产的自动化[7]。

药液进柱控制：根据工艺需要选择吸附柱组别，通过对药液高位罐出液阀控制实现药液自动进柱，采用变频输液泵自动控制每根树脂柱的进液速度，实现进柱药液量的自动控制，同时结合出液流量计、调节阀控制出液速度。

柱液位控制：系统自动检测柱内液位，出现液位低位时自动报警。

有机溶媒洗脱控制：通过对洗脱溶媒罐自动出液阀及变频输液泵的控制实现不同洗脱阶段洗脱溶媒的自动进柱洗脱过程，结合出液流量计及出液调节阀控制洗脱速度。

洗脱液收集控制：根据洗脱过程不同阶段自动切换废液及洗脱收集罐，并且在出液完成后自动完成清洗。[8][9]

2.2 丹酚酸B洗脱液

2.2.1 样品溶液的制备

供试品溶液的制备：取本品用流动相稀释7.5倍。

2.2.2 丹酚酸B的测定

2.2.2.1 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-5mmol/L磷酸二氢钾（30:70）为流动相；检测波长为290nm；柱温24℃，流速为1.0ml/min，进样量为3ul，理论塔板数按丹酚酸B计不低于700。[10]

根据企业标准规定，在此检测条件下，丹酚酸B纯度＞80%，峰面积＞500mAU*s为合格洗脱液 。

2.3 丹酚酸B成品

2.3.1 样品溶液的制备

2.3.1.1 对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品15mg，精密称定，置50m1量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取2ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得[11]。

2.3.1.2 供试品溶液的制备

取本品20mg，精密称定，置50m1量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3.2 丹酚酸B的测定

2.3.2.1 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-5mmol/L磷酸二氢钾（30:70）为流动相；检测波长为290nm；柱温24℃，流速为1.0ml/min，理论塔板数按丹酚酸B峰计应不低于1500，丹酚酸B峰与相邻峰的分离度应大于2.0[12]。

根据企业标准规定，在此检测条件下，按无水物计算，本品中丹酚酸B含量应为80.0～90.0%。

2.4 手动和自动操作丹酚酸B洗脱液的对比研究

2.4.1 手动和自动操作丹酚酸B洗脱液转移率对比研究

分别收集3批次的手动操作和自动操作的丹酚酸B洗脱液，取样检测洗脱液峰面积，计算并对比原手动操作方法与现自动化控制操作方法进行洗脱的洗脱液的转移率[13]。

丹参多酚酸20%乙醇洗脱液转移率计算公式：

理论产量：M标*C标*A样*V样*样品稀释倍数/A标/V标（式1）

转移率：本工序理论产量/上一工序理论产量×100%（式2）

注：A样、A标为样品、标准品峰面积；V样、V标分别为样品、标准品体积（L）；C标%为标准品含量（%）；M标为标准品称重。

2.4.2 手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液量批次稳定一致性对比研究

分别收集20批次的手动操作和自动操作的丹酚酸B洗脱液，每批取样10mL，检测含量，通过计算CPK（过程能力指数Process capability index）进行对比手动操作和自动操作的批次稳定一致性[14]。

CPK= Min[ （USL- Mu）/3σ, （Mu - LSL）/3σ]（式3）

注：USL为标准上限，LSL为标准下限，Mu为平均值，σ为标准差。

2.4.3 手动操作和自动操作的丹酚酸B成品含量对比研究

分别收集20批次的手动操作和自动操作的丹酚酸B成品作为供试品。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪，测定，计算丹酚酸B含量。

按无水物计算，本品中丹酚酸B含量应为80.0～90.0%

注：A对为对照品峰面积；W样、W对分别为供试品、对照品称重（mg）；C对%为对照品含量（%）

3 结 果

3.1 手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液的对比研究

3.1.1 手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液转移率对比研究

手动操作和自动操作的丹酚酸B转移率对比结果表明，手动操作的三个批号转移率分别是69.08%、69.53%、69.89%；自动操作的三个批号转移率分别是73.99%、73.96%、73.82%。综合比较原手动操作方法与现自动化控制操作方法的在吸附洗脱工序转移率明显平均上升。手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液转移率比较见表1。

表1 手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液转移率比较

3.1.2 手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液批次稳定均一性对比研究

通过对20批次手动操作和自动操作控制丹酚酸B洗脱液CPK比较，自动控制和手动控制CPK分别为1.63、1.58，可见他们的过程能力都是比较良好，自动CPK值较高，表明自动操作丹酚酸B洗脱液量离散程度相对于技术标准的公差范围较小，因而过程能力和批间一致性较高[15]。20批次手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液量趋势见图1。

图1 20批次手动操作和自动操作丹酚酸B洗脱液量趋势图

3.1.3 手动操作和自动操作成品含量对比研究

20批次自动控制和手动控制成品丹酚酸B平均含量分别为81.71%和81.22%。综合比较自动化操作相较于手动平均成品丹酚酸B含量较高。20批次手动操作和自动操作丹酚酸B成品含量对比见图2。

4 结论与讨论

4.1 结论

从自控化操作和手动操作的数据进行对比，纯化工序自动化操作的转移率、批间稳定一致性以及丹酚酸B成品含量要优于手动操作。

4.2 讨论

吸附柱收集洗脱液是以HPLC的检验结果来判定的，在收集洗脱液过程不能实现全过程的自动化控制，需要人工干预进行选择。近些年来，近红外光谱法在国内的应用越来越广泛，在中药提取、浓缩、纯化等过程均有应用[16]。因此在后续设备改造过程中可以应用近红外方法来提高吸附柱的整体自动化控制水平，提升产品质量。

图2 20批次手动操作和自动操作丹酚酸B成品含量对比图