贵州省草莓褐色叶斑病病原Pilidium lythri的鉴定

熊仕俊， 孙成龙， 黄 波， 吴奇飞， 龙忠银

(1.安顺学院 农学院， 贵州 安顺 561000； 2.贵州中医药大学， 贵州 贵阳 550025)

草莓褐色叶斑病是一种新发现的草莓病害，在田间表现为叶片坏死和果实腐烂。2012年国内首次报道了病原菌Pilidiumconcavum在北京地区危害草莓导致草莓褐色叶斑病[1]。该病原菌首次在日本发现危害草莓，之后在波兰、巴西、比利时、美国和伊朗等地也有陆续报道[2-5]。目前，未见贵州草莓褐色叶斑病病原鉴定的相关报道。

通过常规的组织分离法对病原菌进行分离纯化，采用形态学观察和rDNA-ITS序列分析相结合的方法，对分离到的草莓褐色叶斑病病原菌进行鉴定，旨在查明贵州草莓褐色叶斑病病原菌的种类，为进一步探究其发生传播规律以及防控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料采集

2018年11月至2019年6月，在贵州省贵阳市(花溪区三五三七厂、青岩)、遵义市播州区(八里、鸭溪)、安顺市西秀区(大寨村、罗仙村)等地的草莓基地，采集有典型褐色叶斑病症状的草莓病株，每个点采集3～5株，带回实验室进行分离。

1.2 病原菌的分离保存

采用常规的组织分离法[6]分离病原菌。从发病组织病健交界处，切取5 mm×5 mm的组织小块，先放在75%酒精中 5～60 s进行表面消毒，随后用5%次氯酸钠中浸泡3～5 min，再放在无菌水中清洗3次，用灭菌滤纸吸干组织表面水分后，将其转移到PDA培养基上，于25℃黑暗条件下恒温培养3～5 d。待其在培养基上长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝或单孢分离的方法进行纯化和转接培养病原菌。

按照柯赫氏法则[6]进行回接，回接后表现出与田间病叶相似褐色病斑症状，再进行病原菌的分离与纯化，于灭菌蒸馏水中4℃冰箱保存备用。

1.3 病原菌的鉴定

采用形态学观察与rDNA-ITS序列分析相结合的方式鉴定病原菌。

1.3.1 形态学观察 将纯化的病原菌接种在PDA平板上，观察并记录其在PDA平板上的生长状况、菌落颜色、菌丝特征等培养性状。将病原菌接种在TPDA(胰蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂)[7]平板上，7 d后通过光学显微数码成像系统观察菌丝形态、分隔状态，孢子的大小、形态与颜色等。综合上述形态特征，参照《真菌鉴定手册》[8]《植物病害诊断》[9]对菌株进行形态学分类。

1.3.2 rDNA-ITS序列分析 采用 CTAB法提取病原菌的基因组DNA，用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[1]进行rDNA-ITS-PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂凝胶电泳检测后，送广州擎科公司测序，测序结果登录GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行 BLAST比对，利用ClustalX和Paup软件分析，构建系统发育树，确定菌株分类地位。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离

从不同批次的发病草莓植株叶部共分离到8株病原真菌，编号分别为Y1、QH、HF-1、HF-2、HF-3、YH-1、YH-2、YH-3；采用离体接种法按照柯赫氏法则进行回接，设置无伤和针刺2组处理。回接后仅Y1出现致病现象，其余编号的菌株回接后，未出现感病现象(或现象不明显)。初步确定Y1为疑似草莓褐色叶斑病病原菌，针刺处理表现出与田间病叶相似褐色病斑症状。

2.2 病原菌的形态学

Y1在PDA培养基上生长缓慢，产孢量极少，28℃恒温培养5 d后菌落直径约5 cm，菌落厚实，菌丝致密、白色，绒毛状，菌落边缘整齐，初期菌落中央淡褐色，后期菌落边缘为淡褐色、中心逐渐变为黄褐色，培养基背面变为深黄褐色(图1)。在TPDA上培养7 d后，镜检发现病原菌菌丝无色、有隔膜；分生孢子卵圆形，顶生，单胞，无色，光滑，大小为(3.5～11.8)μm×(1.5～3.8)μm(图2)。

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列

将病原菌菌株Y1总DNA提取后，进行rDNA-ITS基因测序，将测序结果提交GenBank数据库进行BLAST比对分析发现，菌株与Pilidiumlythri的序列相似度高达97%。基于部分ITS序列，利用Paup软件，以菠菜炭疽病菌(Colletotrichumspinaciae)和束状刺盘孢菌(Colletotrichumtrichellum)为外群，经过分子系统发育分析，病原菌菌株Y1与Pilidiumlythri聚到一起，从进化分支上分析Y1与Pilidiumseptatum、Pilidiumeucalyptorum距离较远(图3)。结合形态学特征，确定引起贵州草莓褐色叶斑病的病原为Pilidiumlythri。

3 讨论

研究对引起贵州草莓褐色叶斑病的病原菌进行了鉴定，综合形态学观察与ITS序列分析，确定为Pilidiumlythri。P.lythri在贵州侵染草莓引起草莓褐色叶斑病属于首次报道，国内目前仅在北京地区发现该病菌危害草莓[1]。

赵新兰等[10]研究发现，P.lythri与P.concavum二者是同一病原真菌的共无性型。P.concavum寄主范围广泛，除危害草莓外，还可危害牡丹(Paeonsuffruticosa)[5]、厚叶岩白菜(Bergeniacrassifolia)[11]、草甸水兰(Hieraciumcaespitosum)[12]、橄榄(Oleaeuropaea)[13]、虎杖(Fallopiajaponica)[14]、欧洲李(Prunusdomestica)[15]等，该病害发病初期在叶片中央或边缘形成圆形、水浸状、褐色病斑，后期病斑逐渐扩大，褐色至黑褐色，中间灰白色，边缘淡褐色，形成肉眼可见的同心轮纹。田间调查发现，该病害在叶片上发病迅速，可侵染果实，导致全果腐烂。在草莓生产上应合理轮作和加强田间管理，从而减少该病菌对草莓的危害。