生物条形码检测技术及其研究进展

刘 培，尹会敏，穆文静，栗 慧，武二斌，魏 东*

1河北北方学院河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室, 河北 张家口 075000；2河北北方学院农林科技学院, 河北 张家口 075000；3河北北方学院张家口市特色农产品质量安全重点实验室，河北 张家口 075000；4张家口市动物卫生监督所, 河北 张家口 075000

近年来，生物条形码检测(bio-bar codes assay，BCA)技术在医学、临床检测、分子生物学、免疫学、纳米技术等领域都有不断的发展和探索。这种超灵敏纳米颗粒扩增检测系统最早于2003年提出，用于检测前列腺特异性抗原(Nametal.,2003)。随着对蛋白质、核酸等大分子和小分子物质的检测分析要求越来越高，传统的免疫分析方法在蛋白质超灵敏检测方面存在不足，其主要原因是缺乏直接扩增技术，如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。因此，在一些检测方法中，条形码DNA需要通过PCR进行扩增，或者对扩增后的条形码进行电泳或联合技术芯片检测。目前，BCA技术已成为临床诊断、微量分析等各个领域的新技术，具有灵敏度高、操作简单、成本低等优点。该技术可实现探针的间接扩增，广泛用于大分子或小分子物质的高灵敏、高特异性检测(Tangetal.,2018)。

1 生物条形码检测技术的原理

BCA是指将相同序列的寡核苷酸作为探针，经化学、静电耦合、自组装等方式将探针固定在金纳米颗粒表面，然后把探针当作检测对象，形成“AUNP-目标物-MMP”的三明治结构，从而实现超高灵敏度检测的方法。用于检测BCA的生物探针分为纳米金颗粒(gold nanoparticle，AUNP)探针和磁性微球(magnetic microparticles，MMP)探针。将该检测技术的操作过程总结为以下几个步骤：制作和识别AUNP探针，MMP探针的制作与识别，夹层结构的形成，获得条形码DNA，检测条形码DNA(高璇等，2016)。BCA是基于纳米金和核苷酸链的信号放大技术通过抗体识别检测高灵敏度目标化合物(Tangetal.,2010)。Nametal.(2003)发现蛋白质和核酸等大分子物质在检测过程中，检测探针和识别探针分别与不同的单抗、多抗及DNA结合，其主要是通过与目的蛋白对应的单克隆和多克隆抗体来实现特异性检测。BCA能够实现多重信号扩增，不需要酶扩增技术，是目前能够实现和PCR具有相同灵敏度且都不需要酶扩增技术的检测方法(杜鹏飞等，2016；刘军等，2015；Aminietal.，2017; Zhangetal.,2010)。

2 生物条形码检测技术的应用

BCA技术被应用于肿瘤标志物、核酸、病毒、食源性病原体、生物毒素和环境污染物的检测。检测蛋白质、核酸等大分子物质时，则是将AUNP表面的条形码DNA修饰并且与目标分子(DNA)相匹配，然后与附在磁性纳米颗粒上的互补DNA混合，形成一个包含DNA-AUNP/目标分子/互补DNA-MMP的三明治结构，从而测定目标分子的数量。Narmanietal.(2018)建立了一种基于MMP和AUNP的荧光DNA生物传感器方法，用于检测霍乱弧菌VibriocholeraeO1OmpW基因，其结果表明，在5～250 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系，检出限为2.34 ng·mL-1。Lietal.(2018)开发了一种基于酪酰胺信号扩增和AUNP标记的免疫测定方法，用电感耦合等离子质谱对α胎儿蛋白进行高灵敏度检测，检出限为1.85 pg·mL-1，线性范围为0.005～2 ng·mL-1，该方法重复性好，可用于血清中其他大分子的检测。虽然BCA技术提高了检测的灵敏度和速度，但其相关实验参数还需进一步优化。

农药、生物毒素等小分子物质的检测则是将运输蛋白的载体物质和农药小分子半抗原结合，并在磁性纳米粒子表面形成MMP探针。把抗体与DNA链在纳米金表面连接，相互反应后，DNA链在AUNP表面又形成纳米复合探针，农药小分子与在磁性纳米粒子表面的抗原产生竞争，并再次结合成纳米金复合探针，那么表面的抗体就会形成竞争型免疫化学反应体系(Duetal.，2016，2018)。Hongetal.(2018)开发了一种直接竞争仿生酶联免疫吸附试验，用于测定样品中的三唑磷。该方法的线性范围为0.001～10000 μg·L-1，回归系数为0.977，其灵敏度和检出限分别为428和0.001 μg·L-1，结果表明该方法更灵敏。Yuetal.(2018)建立了一种检测黄曲霉毒素B1的BCA技术，其灵敏度约为10-8ng·mL-1，远高于ELISA的灵敏度。这也是首次将BCA技术应用于中草药中黄曲霉毒素B1的分析。该方法可用于花生ArachishypogaeaLinn.、腰果AnacardiumoccidentalieLinn.等坚果类食品中黄曲霉毒素B1的微量检测。

3 生物条形码检测技术与其他技术的应用

3.1 基于生物芯片银染的生物条形码免疫分析

近些年，由AUNP和巯基改良组装的寡核苷酸的研究引起了广泛的关注。AUNP表面积比较大，故可以单独结合许多寡核苷酸，且巯基也可通过修改的寡核苷酸使Au-S键与纳米金紧密相连，形成一个探测器，在某些情况下可以与互补的核苷酸序列结合，从而达到核酸检测目的。此方法与银染法结合在检测斑点杂交和芯片等区域，选择性高且灵敏度高。生物条形码免疫分析已通过生物芯片的银染法确立，如大分子物质的检测只能在三明治的结构模型中找到，而小分子物质由于只有一个组件绑定抗原结构模型。因此，目前适用于生物条形码免疫系统分析不适用于小分子物质，如农兽药、生物毒素等(邹艳辉等，2014)。杜鹏飞(2017)利用研究小分子竞争型免疫化学反应体系，建立了基于生物芯片银染技术的高灵敏度可视化BCA技术，使该技术在小分子检测中得到广泛应用。

3.2 基于酶标纳米金探针的生物条形码免疫分析

酶标纳米金技术最早应用于蛋白的检测(Liuetal.,2010b)。Liuetal.(2010a)利用生物素-亲和素系统构筑了新的多功能金纳米复合探针，并开发出了基于纳米金复合探针的免疫法。三明治免疫反应不仅增长了与每一个免疫复合体相关联的HRP分子的数量，同时也增强了信号强度，检测限12 pg·mL-1，具有良好的特异性。利用生物素亲和素系统，可以增强农药残留与生物条形码的敏感性和方便性，再把纳米金复合探针上的复合纳米金探针标记上HRP分子，同时在磁探针结合之前，形成一个竞争系统的检测。

3.3 基于生物传感器的生物条形码检测

生物传感器技术是生物活性物质或生物本身(如酶、组织、微生物、细胞、免疫等)作为识别元件与被检物质发生物理化学反应(如电、光、热、质量)再通过换能器转换为可测的电化学、压电、热学、光学等信号，进行信号检测，从而获得被检物的数量(刘慧等，2021)。Zhengetal.(2018)开发了一种新的生物传感器方法，用AUNP来指示不同浓度的大肠杆菌O157∶H7，并使用智能手机成像APP监测AUNP的颜色变化，来确定细菌的数量。该生物传感器对大肠杆菌的特异性和灵敏度很好，且检出限低于50 CFU·mL-1。王晓飞等(2021)用基于适配体识别和BCA放大策略的电化学发光生物传感器方法研究粘蛋白和特定细胞。通过测量电化学发光强度和细胞浓度的对数相比，当在4～800 pg·mL-1和30～5.0×10-4cells·mL-1范围时呈良好的线性关系，检出限为0.5 pg·mL-1和9 cells·mL-1。该方法为高灵敏的检测蛋白提供了新的方法。

3.4 基于PCR的生物条形码免疫分析

PCR是生物分子扩增的最常用手段，也是核酸检测最敏感的方法。PCR是指在生物体外放大的一种特定的DNA序列的技术。自1985年首次提出PCR概念以来，PCR技术经历了三代技术革新。第一代PCR技术是琼脂凝胶电泳，常用该方法对目的DNA进行定性分析。第二代PCR技术是实时荧光定量PCR(real-time quantification PCR, qPCR)。第三代PCR技术是数字PCR(digital PCR, dPCR)，该概念最初于1999年提出。其中，qPCR已广泛应用于农业、医疗诊断和环境监测等领域。

3.4.1 常规PCR生物条形码免疫分析 PCR技术是当前检测核酸最常用的方法之一。为增强BCA的敏感性，可采用PCR的检验方法。在DNA检测过程中，可将条形码DNA作为模板DNA进行PCR扩增，然后经琼脂糖凝胶电泳来测量条形码DNA的数量。

3.4.2 基于qPCR的生物条形码免疫分析 qPCR是荧光标记或荧光染料结合PCR扩增产物，在此阶段中，直接放大产物的荧光信号值和数量呈正相关的关系，此值可以实时监控样品中核酸的数量，并且依照样品的吸光值，可以得到标准曲线，这是可以准确定量核酸含量的一个示例(Yangetal.,2015)。此方法先将抗体修饰的AUNP、目标物质与MMP混合，形成三明治结构，然后通过竞争反应，将AUNP上的抗体与MMP结合，经加热释放AUNP表面的信号DNA后，再通过PCR和qPCR来检测,该方法的检出限1 fg·mL-1，变异系数3.39%～6.84%(Yinetal.,2012)。为了降低产物的增加与空气环境的干扰，在PCR扩增的过程中，基本上不能打开玻璃管，这样在很大程度上降低了污染的可能性。Jietal.(2018)为了让人血病毒抗原的检测更灵敏，应用了基于qPCR的方法检测。先利用基因库中的特定植物序列与条形码DNA对比无同源性后，然后获得特异性条形码DNA构建重组质粒，此方法的灵敏度高、重现性好。

3.4.3 免疫PCR生物条形码检测技术 传统的PCR、qPCR与BCA的结合改进了BCA的特异性、敏感性及自动化水平，但这些方法仍然离不开磁珠的磁分离过程，使检测过程复杂化，无法达到“下一代”测序样本的测定和计算。在超微量分析检测中，过度的磁分离过程也会导致敏感性的降低和人为操作误差的增加，但是免疫PCR和BCA的结合可以较好地处理这些问题(Caoetal.,2010; Heetal.,2013)。目前，该方法已被应用于病毒、病原体和环境污染物的检测。其原理是将包被在酶标板或PCR管上的抗原抗体反应后，生成夹层复合物。再把捕获的抗体以及被条形码DNA修饰的纳米金复合探针固定在酶标板或PCR管上，之后加热使探针表面的DNA变性释放出DNA条形码，最后用PCR扩增的方法来分析和检测，实现测量目标分子的目的。Guanetal.(2021)用来检测食品中的草甘膦，草甘膦是世界上应用最广泛的广谱除草剂。用基于AUNP的生物条形码免疫PCR方法检测，草甘膦检测的线性范围为61.1 pg·g-1～31.3 ng·g-1，检出限为4.5 pg·g-1，比使用同一抗体开发的常规ELISA(70.0 μg·g-1)低7个数量级且检测时间短，该方法具有良好的敏感性、特异性、回收率和稳定性。

3.4.4 基于数字PCR技术的生物条形码检测技术 dPCR的基本原理是一个样本被无限的稀释，从而将样本分成数百个甚至是数百万个独立的反应单元，在每一个单元里，有一个、多个或者没有目标DNA链，再在每个单元格里进行扩增，扩增结束后再对每个单元格内的阳性和阴性信号进行记录并用泊松分布的统计学原理和方法来对目标分子的含量进行确定(崔雪妍，2019)。微流控芯片数字PCR、微滴数字PCR和水晶数字PCR，其中微滴数字PCR是应用最广泛的。肖芳等(2021)用微滴数字PCR研究转基因玉米MON87427，结果准确度、稳定性均较好。Liuetal.(2019)用微滴数字PCR检测柑橘黄静脉清除病毒(Citrusyellowveinclearingvirus, CYVCV)，该病毒是影响柠檬CitruslimonBurm.生产最厉害的病原菌，在感染潜伏期和高温条件下情况下更易被检测出来，且在实验过程中未扩增出其他相关的柑橘病毒，说明该方法的特异性、准确度、灵敏度更高。

3.5 基于微孔板银染的生物条形码免疫分析

近年来，关于把生物素-亲和素系统使用于BCA技术中的方法越来越普遍，首先将生物素亲和素中具有强亲和力的功能牢固地定在微孔板中，然后加入银染增强液，再利用普通酶标仪来测定放大了信号的条形码，最后可以实现在同一时间内通过肉眼就可以观察其检测的结果(Yangetal.,2008)。为进一步简化BCA检测过程中AUNP探针的制备过程，在AUNP探针表面上只修饰一种巯基单链DNA，如用二硫苏糖醇技术，而不是热变性释放表面的纳米金DNA链(Hill & Mirkin, 2006)。因此，BCA通过与生物素-亲和素联接，就可以构建一个用普通酶标仪就能达到检验农药残留的高敏捷的新方法，并且能够正确地评价此方法。

4 问题与展望

BCA技术与现代标记免疫分析的首选标准ELISA相比，灵敏度高5～6个数量级,检测时间至少节省3 h(Wangetal.2019),这表明BCA测定技术取得了很大的进步。但这种方法本身有缺点，主要出现在条形码DNA分析中。在芯片测试中，因为银染料本身的缺陷，假阳性反应的可能性更高，且会随着时间、环境等因素变化，与其余的核酸检测法相对比，灵敏度没有优势。综合优化反应条件，不仅减少了反应的时间增强检测的灵敏度，而且降低试验成本，更有利于实用和推广。因此，提高此方法的利用率是近年来重要的研究方向。李德雪等(2008)用qPCR替代了传统的PCR和芯片检测方法，建立了荧光定量BCA系统，改进了BCA技术的不足。

经过十几年的发展和探索，BCA技术已经建立了简单可靠的高效体系，可用于蛋白质等大分子物质和小分子物质的检测。与其他检测技术相比，其优势：一是用于BCA技术的纳米材料安全且不易与目标分子结合变性；二是高特异性和高灵敏度使其具有广阔的应用前景；三是该方法在小分子物质检测中性价比高、速度快、操作简单。但是BCA技术尚未完全成熟，方法的每一个组成部分都可能影响其灵敏度和特异性。因此，探索最佳反应条件、降低检测成本、进一步简化操作步骤、提高检测灵敏度、缩短制备和检测时间、实现同一反应体系中多种物质的检测、制备免疫生物条形码试剂盒是未来BCA标准化和商业化的重要研究方向。