小叶白蜡成熟胚离体快繁技术研究

陈清霖

(辽宁林业发展服务中心，辽宁 沈阳 110036)

小叶白蜡为木犀科白蜡属落叶乔木，是第三纪阔叶残遗树种，拥有“阔叶林活化石”的美誉。树干笔直，枝叶茂盛，树形优美，为速生树种，极具观赏价值，是园林绿化的优良树种[1]。随着城市园林绿化产业的发展，小叶白蜡成为城市绿化的一道靓丽风景线，因此对小叶白蜡优质苗木的需求也逐年增加。但采用传统方法播种育苗，培育周期长，且苗木易发生变异。组织培养技术具有繁殖速度快，繁殖系数高，且不受季节限制，可广泛应用于一些特殊品种及濒危树种等，可以挽救濒危树种，满足园林绿化生产苗木需求。近年来，关于白蜡属植物的研究主要集中在器官发生途径[2-10]、体胚发生途径等方面[11-13]。为解决园林生产绿化用苗，快速获得小叶白蜡优质苗木，本研究以小叶白蜡成熟种子的胚为外植体，通过不同消毒处理确定最适消毒时间，筛选出初代、增殖、生根阶段的最佳培养基，建立小叶白蜡快繁体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为小叶白蜡成熟种子的胚。2018年9-10月在辽宁省北票市采种，种子去除其它杂质后放在4 ℃冰箱中贮藏。

1.2 试验方法

1.2.1 诱导培养

成熟种子去翅后用洗衣粉水洗净，清水浸泡种子1～2 h，然后流水冲洗0.5～1 h。将种子置于超净工作台上用70%酒精浸润30 s，0.1%HgCl2消毒8、10、12 min，无菌水清洗5～7次，置于无菌滤纸上取出胚，分别接种于MS、WPM、DKW诱导培养基上，每个处理20粒种子，重复3次，7 d后统计污染率和成活率。

1.2.2 继代培养

将长势良好的无菌苗接种至继代培养基上培养。基本培养基为WPM，分别附加6-BA(0.5、1.5、2.5 mg·L-1)、NAA(0.05、0.15、0.25 mg·L-1)、蔗糖20 g·L-1、琼脂6 g·L-1。2周后观察无菌苗生长情况，统计增殖系数。

1.2.3 生根培养

将增殖培养的无菌试管苗接种在生根培养基上进行生根培养。以WPM为基本培养基，分别添加IBA 1.0 mg·L-1，IBA 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1，光照条件下培养10 d，统计生根率。

1.2.4 炼苗移栽

将小叶白蜡生根苗用流水冲洗掉根部琼脂，然后快速蘸取多菌灵，移栽至草炭土∶蛭石=1∶1混合基质中，2周后统计移栽苗成活率及生长状况。

1.2.5 培养条件

光照强度1 500～2 000 lx，每天光照14 h，温度(25±2)℃。

1.3 数据处理

试验数据用Excel 2010软件处理，用SPSS 22.0软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 消毒时间对小叶白蜡无菌外植体的影响

从表1可以看出，随着消毒时间延长，污染率均下降，消毒10 min的污染率最低15.2%，成活率最高84%，因此小叶白蜡种子最适宜的消毒方法为70%酒精消毒30 s、0.1%HgCl2消毒10 min。

表1 消毒时间对小叶白蜡外植体的影响

2.2 基本培养基种类对小叶白蜡诱导培养的影响

从表2可以看出，接种在WPM培养基内的胚启动较快，接种3～5 d后开始萌动，下胚轴开始出现白色胚根，然后逐渐伸长并逐渐转绿，培养4周后开始展开为两片绿色子叶，叶色正常，诱导率最高90%，因此WPM培养基为后续试验的最佳基本培养基。

表2 基本培养基对小叶白蜡胚诱导培养的影响

2.3 激素组合对继代培养的影响

从表3可以看出，6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1处理的增殖系数最大，无菌苗生长状况明显优于其他处理。因此，小叶白蜡增殖培养最佳激素组合为6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1。

表3 激素种类及浓度对小叶白蜡继代培养的影响

2.4 激素组合对小叶白蜡生根培养的影响

从表4可以看出，添加NAA 0.5 mg·L-1、IBA 1.0 mg·L-1的生根率最高93%，平均生根数5.68条。添加IBA 1.0 mg·L-1处理的生根时间虽早，但主根细弱，后期生长缓慢。添加6-BA 0.5 mg·L-1可能抑制了根的生长。因此小叶白蜡最佳生根培养基为 WPM+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼脂6 g·L-1。

表4 激素组合对小叶白蜡无菌苗生根培养的影响

2.5 炼苗移栽

在培养室将组培瓶打开，让无菌生根苗适应外界环境，炼苗2～3 d后，用镊子将无菌苗取出，用流水冲洗掉根部琼脂，然后快速蘸取多菌灵，移栽至草炭土·蛭石=1·1基质中，成活率82.3%，苗较高，叶片大而绿，无萎蔫及黄化现象，植株健壮。

3 结 论

小叶白蜡成熟种子用70%酒精浸润30 s，然后用0.1%HgCl2消毒10 min，外植体污染率较低，成活率较高。选择MS、WPM、DKW培养基对胚进行离体培养，发现接种于WPM培养基的成熟胚诱导率达90%，叶色健康，苗生长正常。最佳增殖培养基WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1，增殖系数6.5，无菌苗长势最好。最佳生根培养基为WPM+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1，无菌苗主根健壮，须根较多，平均生根数5.68条；将试管苗移栽至草炭土∶蛭石=1∶1基质中，成活率可达82.3%，成功获得小叶白蜡再生植株。