多糖类物质的提取分离、结构鉴定及其生物活性研究进展

陈慧颖，韦体，贾翼玮，郭鹏辉

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124）

天然多糖是由生物体合成的一种生物大分子，主要位于细胞壁、细胞内、细胞间以及分泌质细胞外，是生命活动的必需成分。天然多糖的主要存在形式包括纤维素及其衍生物、海藻酸、琼脂糖、壳聚糖等，生物体内存在的糖分子在机体的生命活动中扮演着重要角色，它的生物学功能丰富多样，在临床试验中具有强大的药理功效，在药品、保健品及化妆品领域也有着广泛的应用。

1 多糖类物质提取分离

多糖的提取方法有多种，一般要根据试验目的和对提取多糖的具体要求选择恰当的提取方法，然后再对多糖的粗提物进行分离纯化，滤去其中的蛋白质、脂质、淀粉、色素等杂质，得到纯化多糖。

1.1 热水浸提法

热水浸提法设备简单，它利用水穿透植物组织的能力，可用于溶于水的多糖提取[1]。具体讲，就是用水作为溶剂浸取多糖，控制温度，用恒温水浴进行回流浸提，过滤出滤液、滤渣。再将滤渣反复浸取几次，把所得全部滤液放在恒温水浴环境下浓缩，边搅拌边加入95%乙醇，多糖呈絮状沉淀析出，离心分离，然后用乙醚或丙酮洗涤，最后进行干燥获得粗多糖。该方法的主要缺点是提取时间较长，且多糖的提取率不够高。

1.2 超声波提取法

1.3 微波辅助萃取法

采用微波使细胞温度升高，细胞内分子无规则热运动速率加剧，细胞压强升高，细胞壁被破坏，多糖类物质充分溢出。用这种方法可以提取出纯度较高的多糖。将原材料干燥后粉碎，经石油醚、乙醇脱脂，然后乙醇提取，去除其中的醇溶性杂质和单糖，过滤后残渣晾干备用；称取除脂后的产物，加入规定用量的溶剂静置后，采取微波样品处理系统，浓缩除去蛋白质，用无水乙醇淋洗，干燥后即可得粗多糖[3]。

1.4 酶解法

酶解法可以破坏细胞壁，使细胞内的蛋白质、多糖等成分溶出，该方法要考虑酶的用量、时间、温度以及pH 值等因素。酶解法提取效率高，降低细胞活化能，多糖释放速率高。在实际中，常用纤维素酶、蛋白酶及果胶酶来辅助提取多糖。郭燕菲等研究了黄花蒿多糖的酶法提取工艺[4]，即先用酶分解蛋白质，然后再浸提多糖，稀释溶液，调整pH 值，加入酶或复合酶制剂，在水浴中进行酶解，最后过滤、浓缩、加入乙醇后沉淀、分离、洗涤，脱水后得粗多糖。

1.5 酸解法和碱解法

酸解法是指加入少量酸液使提取剂呈现弱酸性，加入乙醇溶液，让多糖以沉淀方式析出[5]。酸解法所得的多糖纯度较高，其中的杂质容易去除。碱解法则是向原料中加氢氧化钠等碱性溶液代替酸解法中的酸液，此法适于麸皮、米糠和叶子中半纤维素之类碱性多糖的提取[6]。酸解法和碱解法的缺点是所用稀酸、稀碱的浓度难以控制，多糖提取率不高。

2 多糖类物质的结构鉴定

多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，其分子结构复杂且庞大，可分为一、二、三、四级结构。研究多糖主要研究其一级结构，即单糖的组成、糖苷键的类型、相对分子质量等等。多糖的高级结构决定多糖功能，高级结构不同的多糖即便一级结构相同，其生物活性也差别巨大。多糖结构鉴定的方法主要有物理法、化学法和生物法。

2.1 物理法

物理法主要包括生物质谱和核磁共振等。生物质谱是糖链研究的重要手段，它的主要优点是相对分子质量检测范围大、高通量、高分辨率和高灵敏度，可以应对生物大分子难挥发、热不稳定性等难题。一维及二维核磁共振联用的方法也可以对糖链进行解析，核磁共振法的主要优点是可以利用化学位移、耦合常数、空间偶极耦合、积分面积和弛豫时间不同，在不损坏样品的情况下，对糖链构型和连接方式进行精确解析[7]。

2.2 化学法

传统的化学分析法主要包括甲基化分析、Smith降解和完全酸解法，它们常与质谱、核磁共振法联用，用于研究多糖的糖苷键位置、比例、构型等[8]。

甲基化分析法可以确定糖基间的连接位点[9]：二甲基亚磺酰阴离子可以用二甲基亚砜和NaOH 来制备，用碘甲烷做甲基化试剂，糖链中的游离羟基可变为甲氧基。采用Smith 降解法确定糖苷键的连接方式：高硼氢化钠或碘酸氧化将糖链还原，采用乙酸等弱酸水解，以获取糖连接重复单元，经凝胶过滤、色谱纯化后，利用核磁共振法确定糖基的构象及其连接方式。采用完全酸解法获取糖链中糖基的组成及其比例：将多糖链置于酸中，通过加热使其彻底水解，或将其置于盐酸-无水甲醇中用甲醇解，用气相或液相色谱等方法对生成的糖基混合物或糖基、甲基糖苷混合物做定性与定量分析。

2.3 生物法

2.3.1 酶学方法

酶学法能够进行糖链结构的分析：取纯化的多糖试样，将试样与外切糖苷酶混合物一起保温酶解，把每次酶水解得到的产物合并，采用凝胶渗透色谱分离，与数据库中图谱进行对照，即可确定结构[10]。

2.3.2 免疫学方法

免疫学方法的原理是：多糖会抑制抗体和抗原的结合，不同结构的多糖有不同的抑制常数，抑制常数接近的多糖，其结构往往是相似的。通过寻找能对抗原和抗体的结合产生抑制作用的多糖，测定其抑制常数，再与已知结构的糖链做比较，即能了解该多糖的结构。

3 多糖类物质的生物活性应用研究

多糖类物质对包括人在内的生物体有着重要作用，是重要的生物活性物质，已经被广泛地应用于药品、保健品以及化妆品等领域。

3.1 多糖类物质对人体的作用

3.1.1 抗肿瘤作用

WANG 等人用不同剂量的人参多糖来抑制小鼠肺癌肿瘤细胞的生长，验证了人参多糖的抗癌效果[11]。大量动物实验和临床研究报道表明：香菇多糖能够抑制肿瘤生长并提高免疫功能。目前，香菇多糖主要用于增强放化疗疗效、降低肿瘤治疗相关不良反应、提高免疫效应和改善患者生存质量等方面[12]。

3.1.2 治疗糖尿病

糖尿病及其并发症已成为全球性的医学问题。XIE 等[13]人评估了美国人参果提取物中多糖组分的抗高血糖作用，发现人参果多糖能够有效控制空腹小鼠的血糖水平。

3.1.3 抗氧化

AKASHI 等[14]研究了人参多糖的抗氧化作用。结果表明，人参多糖有自分泌机制，可自我激活，且细胞外的一些蛋白激酶也参与了人参多糖对血液中超氧化物歧化酶的激活作用。

3.1.4 免疫调节

研究发现，不同多糖具有不同的免疫促进作用，香菇多糖、灵芝子实体多糖、银耳多糖、黑木耳多糖以及从猪苓菌核中提取的水溶性多糖，都可提高小鼠巨噬细胞的吞噬性能。WANG 等[15]研究了人参多糖的免疫调节功能，表明其能够刺激产生活性氧中间体，是一种十分有效的非特异性免疫调节剂。

3.1.5 护肝作用

为了使人参多糖作为保肝药物应用得到更广泛的认可，SHIMET 等[16]验证了人参多糖在四氯化碳诱导肝损伤方面的保护作用。此外，中华猕猴桃多糖能够清除活性氧自由基，刺五加果多糖、云芝胞内多糖、竹黄多糖等对小白鼠的急性四氯化碳肝损伤有较好的保护作用[16]。

3.1.6 抗辐射作用

人参多糖具有抗辐射作用，它能抑制辐射导致的抗氧化酶紊乱，减轻辐射伤害[17]；黑木耳多糖、茶多糖、银耳多糖等都具有抗辐射作用；而螺旋藻水溶性多糖可以降低因辐射引起的基因突变概率。

3.1.7 抗炎症作用

人参多糖可通过抑制自身反应性T 细胞的增殖以及炎症因子的表达，来改善自身免疫性脑脊髓炎的发生。WANG 等[18]发现，人参多糖可抑制炎症相关因子的释放，治疗炎症及其相关疾病。

3.2 在生物医用材料领域的应用

近年来，以天然多糖材料作为基材在生物医学领域进行各种功能化设计已成为科研领域的热门课题[19]。根据功能应用的分类，主要用于包括药物载体、组织工程、支架材料以及伤口敷料等需求缺口较大的领域中。

在药物载体研究上，常选用天然多糖作为基材，设计出各种药物缓控释系统，让药物释放更加安全可靠，进而提高靶向治疗的有效性；在组织工程研究中，一些复合材料得到广泛的应用，例如RAMOS 等[20]探讨了天然多糖基功能化支架在肌腱愈合和再生方面的应用；在支架材料上，由于天然多糖基材料的生物相容性和生物可降解性良好，被应用于人工关节、人工牙齿以及心血管医用材料等方面；在伤口敷料上，天然多糖分子表面含有大量活性基团可进行功能化修饰，在材料的韧性、强度及疏水性方面都能获得良好效果。

3.3 在化妆品行业中的应用

植物多糖已经越来越多地应用于化妆品行业，其主要优势体现在：一是植物多糖具有丰富的生物活性，能够起到保湿、抗氧化、抗皱、美白、抑菌、祛痘、抗敏、消炎、防晒、除螨以及愈创等作用；二是植物多糖含有亲水性基团，乳化性和成膜性好，容易形成凝胶，更适合添加到日化用品中。植物多糖类化妆品具备更为广阔的开发和应用前景[21]。

4 结语

多糖类物质对生命体有着重要作用，其在生物医用材料、化妆品行业中有着广泛的应用。在今后的研究中，应引入现代分子生物学技术,寻找多糖类物质的化学结构与其功能之间的联系，深入研究多糖在体内代谢和作用的机理，明确多糖物质的药理机理和化学结构，加强多糖类物质应用的科学理论研究。