酶法制备鸡血抗氧化肽及其抗氧化活性

宁芯 ，黎梓玉，班薇薇，黄小惠，莫紫梅，汪磊 *

1. 广西农产资源化学与生物技术重点实验室（玉林 537000）；2. 广西高校桂东南特色农产资源高效利用重点实验室（玉林 537000）；3. 玉林师范学院化学与食品科学学院（玉林 537000）；4. 广西-东盟食品检验检测中心（南宁 530001）

自由基是需氧生物在正常生理过程中产生的一类性质活泼的化学物质，这类物质在生物机体内扮演重要作用，包括信号传递、预防感染和排除毒素等[1]。自由基在正常生物机体内处于动态平衡，若失衡，长期过量的自由基通过与脂类、蛋白质和核酸等生物大分子作用，易引发癌症、心脑血管疾病、关节炎症、老年性视力障碍等疾病。据统计，自由基侵害约占影响人体健康因素的85%[2-3]。

适量摄入具有抗氧化活性的物质能有效降低机体的自由基水平，防止脂类物质过氧化，提高机体免疫力[4]。各类抗氧化物质中，从某些动植物组织中提取的天然抗氧化剂具有抗氧化能力强、稳定性强和安全性高等特点，深受消费者青睐，但其含量普遍较低[5-6]，实际意义不大。科研人员在近期研究过程中发现：可控酶法水解蛋白质制备具有抗氧化活性的多肽具有反应温和、可控性好和安全性高等优点，是当前生产天然抗氧化剂的主要方法[7]。

据统计，我国肉鸡年出栏量高达40亿只，肉鸡含血量在80～100 g/只，粗略估计，鸡血年产量约36万 t，数量相当可观[8]。研究表明：鸡血干物质含量约17.9%，其中91.8%为优质蛋白质[9]，是一种具有良好开发潜力的蛋白质资源。猪血[10]、牛血[11]、鹅血[12]和鸭血[13]等畜禽动物血液均可作为廉价蛋白质来源制备抗氧化肽，而当前我国鸡血主要经过简单加工后作为饲料添加物使用，附加值极低。基于此，赵亮等[14]、郑召君等[15]和曾利平等[16]尝试以鸡血血球为原料制备抗氧化肽，但制备过程中产生大量的鸡血血浆（以体积计，血浆约占血液的55%），降低了鸡血蛋白的利用率，影响鸡血的高值化利用。此次试验以新鲜鸡血为原料，通过渗透吸水破坏鸡血血球细胞结构，在此基础上采用酶法水解制备鸡血抗氧化肽，研究各单因素（pH、加酶量、酶解温度和酶解时间）对鸡血酶解产物还原能力的影响，并采用响应面法优化鸡血酶解条件，旨在为鸡血高值化利用提供有益途径和理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

新鲜鸡血（取自白羽肉鸡，市售）；碱性蛋白酶（生化试剂，2×105U/g，北京奥博星生物技术有限责任公司）；氢氧化钠、盐酸、铁氰化钾、三氯乙酸等（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

电子天平（AR224CN型，奥豪斯仪器（常州）有限公司）；磁力搅拌水浴锅（SHJ-2A型，常州金坛良友仪器有限公司）；台式高速离心机（H1850R型，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；实验室pH计（ST2100型，奥豪斯仪器（常州）有限公司）；紫外-可见分光光度计（UV-1600型，上海美谱达仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 鸡血抗氧化肽的制备工艺

新鲜鸡血→加入浓度为4%的抗凝剂（柠檬酸钠）→破胞（加3倍体积蒸馏水充分搅拌）→热变性处理（90 ℃，20 min）→冷却→调pH→碱性蛋白酶水解→灭酶（沸水浴10 min）→离心（3 500 r/min，15 min）→取上清液→分析检测

1.3.2 还原能力的测定

参照Ye等[17]的方法。取2.5 mL鸡血酶解液，分别加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 10 mg/mL铁氰化钾，充分混匀，于50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 100 mg/mL三氯乙酸，混匀后10 000 r/min离心15 min，取2.5 mL上清液，分别加入0.5 mL 1 mg/mL三氯化铁和2.0 mL蒸馏水，混匀后于700 nm波长比色。

1.3.3 清除DPPH自由基能力测定

参考Wu等[18]的方法，配制不同浓度的鸡血酶解物溶液，于517 nm波长比色，计算溶液清除DPPH自由基能力。

1.3.4 清除羟自由基能力测定

参考王强等[19]的方法，配制不同浓度的鸡血酶解物溶液，于536 nm波长比色，计算溶液清除羟自由基能力。

1.3.5 单因素试验

试验分别以pH（8.0，9.0，10.0，11.0和12.0）、加酶量（4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g）、酶解温度（40，45，50，55和60 ℃）和酶解时间（20，40，60，80和100 min）为影响因素进行单因素试验，研究单因素对鸡血酶解物还原能力的影响。

1.3.6 响应面试验

基于单因素试验结果，根据Box-Behnken中心组合设计（BBD）的试验原理，选取对鸡血酶解物还原能力有显著性影响的pH、加酶量、酶解温度和酶解时间为自变量，以鸡血酶解物的还原能力为响应值，采用四因素三水平的响应面分析法优化鸡血酶解工艺。响应面因素水平编码表见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素和水平

1.4 统计处理

应用SPSS 17.0软件和Design-Expert 8.0软件处理试验数据。采用Duncan检验进行显著性分析，p＜0.05判定为变化显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 pH

pH对鸡血酶解物还原能力影响显著（图1），鸡血酶解物还原能力随pH的增大呈现先增大后下降的趋势。当pH为11.0时，鸡血酶解物的还原能力最强。其主要原因是试验所用碱性蛋白酶的最适pH为11.0，如偏离蛋白酶的最适pH，酶活明显降低，影响酶解物的水解度和还原能力。

2.1.2 加酶量

加酶量显著影响鸡血酶解物的还原能力。图1表明：在4 000～10 000 U/g范围内，鸡血酶解物的还原能力随加酶量的增加而增强，当加酶量超过10 000 U/g时，鸡血酶解物还原能力变化不显著。其原因可能是在一定的底物质量浓度下，增加酶用量提高了碱性蛋白酶与鸡血蛋白的结合率，进而加快了酶解的速率，但当酶蛋白分子过于饱和后，酶解速率无显著性增大，酶解产物的还原能力趋于平稳，如继续加大蛋白酶的用量反而会增加生产成本，因此选择10 000 U/g作为最适加酶量。

2.1.3 酶解温度

通常情况下，酶促反应随着温度的升高而加快，但是当温度超过一定范围后，酶的活性随之下降甚至会变性失去活性。试验研究了酶解温度对鸡血酶解物还原能力的影响，结果见图1。酶解温度对鸡血酶解物还原能力影响显著，随温度的升高，鸡血酶解物的还原能力呈先上升后下降的趋势，当酶解温度为45 ℃时，鸡血酶解物的还原能力最大。

2.1.4 酶解时间

图1表明：鸡血酶解物还原能力随酶解时间的延长呈先上升后下降的趋势，当酶解时间为80 min时，鸡血酶解物还原能力最大，进一步延长酶解时间，鸡血酶解物还原能力反而大幅度下降。其原因可能是随着酶解时间的延长，具有还原能力的肽段进一步水解，形成了还原能力较小或不具还原能力的肽段[20]。

图1 各因素对鸡血酶解物还原能力的影响

2.2 响应面法优化鸡血抗氧化肽酶解工艺

2.2.1 试验设计与结果

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计原理，选取pH（A）、加酶量（B）、酶解温度（C）和酶解时间（D）为影响因素，以鸡血酶解物还原能力为响应值，进行四因素三水平的响应面分析，试验方案及结果见表2。

2.2.2 回归方程方差分析

利用Design-Expert 8.0对试验结果进行多元回归拟合，得到以鸡血酶解物还原能力（Y吸光度）对各因素的回归方程：

Y=0.57+0.068A+0.034B+0.026C-5.833×104D-0.029AB+5.500×105AC-0.020AD+8.900×103BC-3.400×103BD+5.500×103CD-0.096A2-0.076B2-0.12C2-0.046D2

2.2.3 模型及回归方程系数的显著性检验

对回归模型方差进行分析，结果见表3。该模型的p=0.000 1＜0.01，说明试验所选用的模型具有高度的显著性，试验设计方案正确，可以用来预测响应值。模型中A、A2、B2和C2对鸡血酶解物还原能力影响极显著，B和D2对鸡血酶解物还原能力影响显著，其他项系数均不显著。在选取的因素水平范围内，按照对结果的影响排序，pH＞加酶量＞酶解温度＞酶解时间。失拟项F值为913.98，表明数据中有少量异常点。

根据分析结果绘制响应面曲面图，结果如图2所示。等高线是椭圆形，则表示两因素交互作用显著，同时沿因素轴向等高线变化越密集，则该因素对响应值影响越显著，反之越弱[21]。由图2可知，4个因素对鸡血酶解物还原能力影响大小顺序依次为pH＞加酶量＞酶解温度＞酶解时间，结果与表3一致。

表2 响应面试验设计与结果

表3 回归方程方差分析

图2 各因素对鸡血酶解物还原能力影响的响应面图

2.2.4 最佳酶解工艺条件的验证结果

通过Design-Expert 8.0软件得到碱性蛋白酶酶解鸡血的最佳工艺参数：pH 11.34，加酶量10 335 U/g，酶解温度45.56 ℃和酶解时间78.41 min。在该条件下，鸡血酶解物还原能力的吸光度预测值为0.581 8；考虑到实际的可操作性，将上述工艺参数调整为pH 11.3，加酶量10 335 U/g，酶解温度46 ℃和酶解时间78 min。对调整后的优化的条件进行验证试验，结果表明，鸡血酶解物还原能力的吸光度为0.570 1，与理论预测值基本吻合，因此基于响应面法所得的优化酶解参数是准确可靠的。

2.3 鸡血酶解物主要组成成分及抗氧化活性

鸡血酶解后冻干，检测其主要组成成分，结果见表4。鸡血酶解物冻干粉粗蛋白含量高达71.15%，脂肪含量低于1%，是典型的高蛋白低脂类原料。值得注意的是，由于酶解过程中需加入较多的酸碱试剂调节酶解所需的pH，鸡血酶解物冻干粉的灰分含量接近20%，因此后续使用中需进行脱盐处理。

表4 鸡血酶解物主要组成成分

表5 鸡血酶解物体外抗氧化能力

将鸡血酶解物冻干粉配制成不同浓度的溶液，研究鸡血酶解物在化学模拟体系中的抗氧化活性，结果见表5。鸡血酶解物的还原能力随浓度的增大而增强，且在该范围内呈现较好的量效关系（R2=0.94）。鸡血酶解物具有良好的清除羟自由基的能力，且与浓度呈显著正相关（R2=0.97），当鸡血酶解物的质量浓度为15.0 mg/mL时，羟自由基的清除率高达99.2%。此外，鸡血酶解物还具备一定清除DPPH自由基的能力，15 mg/mL鸡血酶解物DPPH清除率为64.58%。

3 结论

1) 以新鲜鸡血为原料，采用渗透吸水破坏鸡血血球细胞结构，在此基础上应用响应面分析法优化鸡血的酶解工艺。结果表明，鸡血酶解的最佳参数为pH 11.3，加酶量10 335 U/g，酶解温度46 ℃，酶解时间78 min。与以往酶法水解鸡血球制备抗氧化肽相比，该方法有利于鸡血蛋白的充分利用。

2) 体外抗氧化活性试验证实鸡血酶解物具有良好的抗氧化能力，15.0 mg/mL的鸡血酶解物DPPH自由基清除率和羟自由基的清除率分别为64.58%和99.2%，可有望作为天然抗氧化剂和功能性食品原料。