在线固相萃取-液相法测定新疆南瓜中生育酚

林毅侃，印杰，林琳，张雯，黄雨晴，葛宇

上海市质量监督检验技术研究院/国家食品质量监督检验中心（上海）（上海 200233）

南瓜是一年生蔓生草本植物，由于其抗逆能力强、适应性强、产量高、营养价值高，在世界各地均有种植，尤以亚洲栽培面积最多[1]。南瓜由17%的皮、73%的果肉和10%左右的南瓜瓤组成[2]。南瓜中营养丰富并且全面，富含果胶、纤维素、淀粉、脂肪、甘露醇、各种水溶性维生素、生物碱、β-萝卜素和生育酚等[3-6]。

生育酚为脂溶性维生素的一种，是维持机体正常生长、发育、代谢和其基本生理所需功能的必要物质，具有抗氧化、防止衰老、提高机体免疫力、保护肝脏功能、抗肿瘤和预防心脑血管疾病等功效。然而生育酚在结构上极其不稳定，在光照、氧气、高温及极端pH条件下极易被破坏[7-9]。脂溶性维生素的有关检测方法主要有比色法、荧光法、分光光度法、电化学法、免疫分析法、高效液相色谱法[10-12]。国家标准规定的是使用高效液相色谱法进行测定。方法采用将样品在高浓度碱性条件下进行皂化后再进行液液分配和浓缩步骤，需要采用复杂的前处理，消耗大量有机试剂，并涉及多次蒸发和溶解步骤。耗费大量人力物力的同时，也增加试验难度，复杂的检测步骤导致生育酚损失，造成回收率下降，待测成分被破坏等情况。试验采用在线固相萃取-高效液相色谱技术，建立同时检测4种生育酚的方法。该方法具有分析效率高、前处理简单、试验试剂消耗少、结果重复性好等特点，不仅缩短分析时间，也减少试验步骤过于繁琐所带来的系统误差及目标物的损失，并对不同产地来源的南瓜样品中的生育酚进行测定，以期为南瓜中生育酚的快速检测和深入研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南瓜（上海艾妮维农产品专业合作社从新西兰引进的小南瓜品种，所需样品均采自新疆喀什地区泽普县的南瓜试验示范种植基地；样品于2018年4月26日播种、2018年6月5日开花；其余南瓜均为市售；见表1）。

α-生育酚（标准品，SIGMA公司）；γ-生育酚（标准品，SIGMA公司）；δ-生育酚（标准品，SIGMA公司）；氢氧化钾（分析纯，国药）；乙腈（色谱纯，国药公司）；甲醇（色谱纯，国药公司）；乙醇、超纯水（自制）。

表1 试验用南瓜信息

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Agilent-1260）、六通阀（1个）、安捷伦1260四元泵，安捷伦二元泵，紫外检测器；色谱柱：BE ONLINE PLRP-S，2.1 mm×12.5 mm、Poroshell PFP，3.0 mm×100 mm。天平（METTLER TOLEDO公司）；离心机；超声仪；水浴锅；等。

1.3 标准溶液的配制

分别精确称取0.100 0 g 4种生育酚标准样品各于100 mL容量瓶中，用乙醇进行定容，得到质量浓度1.0 g/L标准储备液，此1 mL溶液相当于1.0 mg生育酚。用该储备液配制成4种生育酚混合标准液。

1.4 色谱条件

Online SPE泵，安捷伦1260四元泵；液相泵，安捷伦二元泵；检测器，紫外检测器；SPE柱，BE ONLINE PLRP-S，2.1 mm×12.5 mm；液相分析柱Poroshell PFP，3.0 mm×100 mm；流动相：SPE泵，水-乙醇（20∶80，V/V），流速1.0 mL/min；液相分离泵，甲醇-乙腈（梯度洗脱，洗脱条件见表2），流速1.0 mL/min。液相色谱柱柱温：室温（30 ℃左右）；阀切换时间0.00 min（位置1～2），4.00 min（位置1～6），15.00 min（位置1～6）。检测波长294 nm；进样体积100 μL。装置连接示意见图1。

图1 液相色谱装置连接示意图

表2 液相泵梯度洗脱表

1.5 样品处理

称取3 g待测样品，加入10 mL温水涡旋溶解后，加入10 mL乙醇和4 mL 50%氢氧化钾水溶液，放入82℃水浴锅皂化20 min，冷却后用1∶1乙醇水溶液定容至50 mL，离心过0.22 μm滤膜进样。

2 结果与讨论

2.1 系统流路的配置和一维色谱阀切换时间的确定

生育酚检测前处理非常复杂，需要样品在强碱溶液皂化后使用乙醚、石油醚等有机试剂液液分配萃取，水洗多次，旋转蒸发等提取步骤，操作繁琐，对人员操作要求较高。因此会造成检测效率低下、数据误差偏大等问题。基于此，试验对系统流路进行优化，在普通液相的前端，增加一根以刚性高聚合物为填料的能够耐强碱的PLRP-S净化柱。该配置可以满足直接使用强碱的皂化液进行生育酚的检测。同时PLRP-S净化柱具有反向色谱吸附分离原理，在1 mL—水甲醇流动相条件下，皂化液中的目标物质会被吸附于净化柱上，在经过Online SPE泵数分钟的流动相冲洗后，碱液及部分杂质被冲洗进入废液管路，保护后续用于分离的液相色谱柱及仪器系统不收任何破。经过六通阀的转换，液相泵的流动相进入净化柱内，将目标物质洗脱入液相分析柱进行色谱分离。通过连续进样，确定在4 min左右的SPE冲洗时间，洗脱液的pH达到中性，并且富集在净化柱上的生育酚并没有损失，因此确定六通阀的最终切换时间为4 min。

2.2 液相色谱条件优化

普通的C8或者C18色谱柱无法分离β-生育酚和γ-生育酚。使用PFP为填料的色谱柱，由图2和图3可见，在洗脱溶剂为甲醇和乙腈的情况下，PFP色谱柱可以很好地分离4种不同的生育酚。考虑到在切换流动相后，必须使用高浓度的有机相才能将SPE柱上富集的生育酚迅速、完全地冲洗下来，并且还需要保证4种生育酚的分离度及其与样品液中残留杂质的分离度，液相条件采用梯度洗脱。

图2 4种生育酚色谱图

图3 南瓜样品色谱图

2.3 生育酚的定量检出限

前处理简化萃取和浓缩的步骤，相应地增大样品的稀释倍数，为了能够达到国家规定的检出限，方法将进样量扩大到100 μL。使用空白样品进行加标试验（加标量0.120 mg/100 g），结果表明在进样量100 μL条件下，色谱峰相应较高，能够准确积分和定量，该试验条件能够满足国标要求的检出限。

2.4 线性关系

按1.4色谱条件，吸取标准系列溶液各100 μL进行进样检测。以标准系列溶液的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，作标准曲线（图4～图6），并进行线性回归得到标准曲线方程。

α-生育酚：Y=41.317 02X+1.164 08，r2=0.999 81。δ-生育酚：Y=29.487 80X-0.768 598，r2=0.999 91。γ-生育酚：Y=43.798 04X-1.004 96，r2=0.999 67。

图4 α-生育酚标准曲线

图5 γ-生育酚标准曲线

图6 δ-生育酚标准曲线

2.5 回收率和精密度

分别在南瓜样品中添加0.120，0.240，0.600和1.20 mg/100 g的4种生育酚，每个水平重复测定6次，外标法定量，扣去本底后结果见表3。

表3 空白南瓜基质中α-生育酚、γ-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚加标收率及相对标准偏差（n=6）

2.6 样品测定

采用方法对表1所列的18份南瓜样品进行测定。结果见表4。

表4 南瓜样品检测含量 mg/100 g

3 结果与展望

试验在普通液相的配置上增加一泵一阀，搭建在线固相萃取-高效液相色谱法直接检测南瓜样品皂化液中的3种生育酚。方法检出限与GB 5009.82—2016保持一致，且测定结果的重复性好，加标回收准确可靠。以此色谱条件测定的18份南瓜样品中的生育酚含量差异明显，新疆喀什种植的南瓜的生育酚含量普遍高于其余品种的南瓜，营养价值明显。

方法从原理上可以满足各种不同基质的食品中的检测，不仅限于南瓜产品，在后续试验中，可进一步测试其他基质食品，完善数据，增大方法适用性。