BIM联合Scribble预测晚期非小细胞肺癌化疗效果

张龙富，姚家美，蒋冬先，侯英勇，张 新

1.上海市徐汇区中心医院呼吸科，上海 200031；2.复旦大学附属中山医院呼吸科，上海 200032；3.复旦大学附属中山医院病理科，上海 200032

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，且其发病率和死亡率仍在上升［1-2］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%，大部分患者首诊时已处于中晚期，失去了手术治疗机会，通常采用以放化疗为主的治疗手段，5年生存率小于15%［3］。

21世纪以来，肺癌的靶向治疗和免疫治疗取得较大进展。多项研究证实，驱动基因阳性的NSCLC患者使用靶向治疗效果优于传统化疗［4-6］，但突变概率最高的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）只有50%左右［7］。KEYNOTE-042研究显示，帕博丽珠单抗一线单药治疗驱动基因阴性但程序性死亡［蛋白］配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）阳性的NSCLC患者总生存期（overall survival，OS）优于传统化疗［8］。但EXPRESS研究结果显示，PD-L1＞1%为51.6%，PD-L1＞50%为22.2%［9］。因此有较大部分患者不能从靶向治疗和免疫治疗中获益，仍需以化疗为一线治疗。而且靶向治疗或免疫治疗的患者耐药后，化疗是延长生存的重要选择。含铂双药方案是晚期NSCLC的标准化疗方案，但其疗效个体差异较大，客观缓解率（objective response rate，ORR）仅为25%～35%，因此早期识别对化疗有反应的人群至关重要［10-11］。

Bcl-2基因家族是细胞凋亡进程中重要的决策者，BIM基因也叫BCL2L11基因，只包含一个促凋亡的BH3结构域，是调节细胞死亡的重要介质［12］。BIM基因的BH3域缺失，容易引起凋亡受阻。Ng等［13］研究发现，在EGFR基因突变的NSCLC患者中，BIM基因缺失型使用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的中位无进展生存期（progression-free survival，PFS）比BIM基因野生型短（6.6个月vs11.9个月，P=0.027）。Lee等［14］研究发现，BIM基因多态性与NSCLC化疗效果有相关趋势，BIM基因缺失型患者化疗具有更短的中位PFS（3.5个月vs5.6个月，P=0.05）。极性蛋白Scribble定位在上皮细胞顶端部位，Scribble的错位和缺失存在于多种恶性肿瘤中，对肿瘤细胞增殖、肿瘤转移和耐药有促进作用［15］。Wang等［16］的研究探讨Scribble表达水平与晚期NSCLC含铂化疗效果的相关性，结果显示，Scribble高表达组的中位PFS明显优于Scribble低表达组（5.5个月vs3.6个月，P=0.012）。

从上述研究可见BIM基因和Scribble均有促进肿瘤细胞凋亡的作用，影响NSCLC的化疗效果。但单独应用时，BIM基因野生型和Scribble高表达组的化疗PFS与既往研究报道的4～6个月相仿。本研究旨在探讨BIM基因多态性联合Scribble表达水平预测晚期NSCLC化疗效果的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集复旦大学附属中山医院2014年1月—2015年12月确诊的NSCLC患者96例。入组标准：①年龄＞18岁；② 组织病理学检查确诊为NSCLC，TNM分期为Ⅲb或Ⅳ期；③所有患者既往均接受过一线含铂药物方案化疗，有详细的随访资料，可以进行疗效评价，有完善的PFS和OS数据，PFS定义为从随机化开始到肿瘤发生（任何方面）进展或（因任何原因）死亡的时间，OS定义为从随机化开始到（因任何原因）死亡的时间；④ 所有标本均应是化疗前的肿瘤标本。

1.2 DNA抽提

手术标本的石蜡包埋组织切取4 μm厚切片5张，活检标本的石蜡包埋组织切取切片10张。DNA抽提采用QIAampDNA FFPE组织试剂盒（德国Qiagen公司），实验步骤参考说明书。提取并重悬DNA后经NanoDrop 2000（美国Thermo Fisher Scientific公司）检测其浓度及纯度。

1.3 BIM基因多态性的检测

对标本提取的D N A 行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，PCR扩增产物：BIM基因野生型长度为216 bp，BIM基因缺失型长度为173 bp。BIM基因野生型上游引物：5’-ACTGTAAAACGACGGCCAGTCCTC ATGATGAAGGCTAACTCAA-3’；下游引物：5’-ACCAGGAAACAGCTATGACCAACCTCTG ACAAGTGACCACCA-3’；BIM基因缺失型上游引物与BIM野生型一致，下游引物：5’-ACCAG GAAACAGCTATGACCGGCACAGCCTCTATGG AGAACA-3’。PCR条件：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40个循环；72 ℃终延伸10 min。4 ℃取出，低温保存。对样本DNA的PCR扩增产物进一步行4%琼脂糖凝胶电泳，通过观察DNA条带的差异鉴别BIM基因多态性的类型。

1.4 Scribble蛋白水平的检测

Scribble蛋白的免疫组织化学染色方法和Elsum等［17］的研究一致。以肿瘤细胞的细胞膜和（或）细胞质着色为基准，根据切片中阳性细胞染色强度及百分比将表达结果分为0、1+、2+和3+四个等级。0：无染色或≤10%肿瘤细胞浅染色；1+：＞10%肿瘤细胞浅染色；2+：＞10%肿瘤细胞中度强染色；3+：＞10%肿瘤细胞强染色。本结果由3名病理科医师各自单独评分，结果经汇总，对有差异的评分经复核商讨后得到最终一致结果。0和1+为Scribble低表达，2+和3+为Scribble高表达。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析，均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。各亚组间临床特征以及临床疗效相关ORR、疾病控制率（disease control rate，DCR）的比较采用χ2检验或Fisher精确检验法。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法，各亚组间差异比较采用log-rank检验。多因素分析采用COX回归模型。

2 结果

2.1 患者一般临床特征

共入组96例NSCLC患者，均一线接受含铂双药方案化疗。BIM基因缺失型组与BIM基因野生型组之间的各项临床特征无差异，Scribble高表达组的EGFR突变率高于Scribble低表达组，其他临床特征无差异，详见表1。

表1 患者一般临床特征Tab.1 General clinical characteristics of the patients

2.2 BIM基因多态性检测结果判定

BIM基因野生型经扩增后目的片段长度为216 bp，BIM基因缺失型包括纯合型和混合型，纯合型为173 bp，混合型为216和173 bp两个条带都有。检测结果显示，16例（16.7%）患者为BIM基因缺失型，均为混合型；80例（83.3%）患者为BIM基因野生型，部分检测结果见图1。

2.3 BIM基因多态性与化疗效果的关系

BIM基因野生型组的中位PFS为5.0个月（95% CI：4.2～5.7个月），明显优于BIM基因缺失型组的2.7个月（95% CI：0.7～4.6个月，P=0.003）。BIM基因野生型组的中位OS与BIM基因缺失型组差异无统计学意义（11.6个月vs12.5个月，P=0.7，图2）。在ORR方面，BIM基因野生型为41.2%，高于BIM基因缺失型的18.7%，但差异无统计学意义（P=0.09）。在DCR方面，BIM基因野生型和BIM基因缺失型差异无统计学意义（75%vs56.2%，P=0.223）。

图1 BIM基因多态性检测结果Fig.1 BIM gene polymorphism detection result diagram

图2 BIM基因多态性与化疗PFS和OS的关系Fig.2 Kaplan-Meier curves of PFS and OS to chemotherapy according to BIM gene polymorphism

2.4 Scribble表达检测结果

检测结果显示，36例（37.5%）患者为Scribble高表达，60例（62.5%）患者为Scribble低表达，部分检测结果见图3。Scribble高表达与低表达组之间EGFR突变状态有差异，其他临床特征无差异（表1）。Kappa一致性分析显示，Scribble表达与BIM基因无相关性（Kappa值为0.15，P=0.09）。

2.5 Scribble表达与化疗效果的关系

Scribble高表达组的中位PFS为7.0个月（95%CI：4.9～9.0个月），优于Scribble低表达组的4.0个月（95% CI：2.9～5.0个月，P＜0.001，图4）。Scribble高表达组的中位OS为19.5个月（95%CI：11.4～27.5个月），也优于Scribble低表达组的9.5个月（95% CI：8.0～10.9个月，P=0.001，图4）。在ORR方面，Scribble高表达组为52.7%，明显优于Scribble低表达组的28.3%，差异有统计学意义（P=0.017）。在DCR方面，Scribble高表达组和Scribble低表达组差异无统计学意义（80.5%vs66.6%，P=0.143）。

图4 Scribble表达与化疗PFS和OS的关系Fig.4 Kaplan-Meier curves of PFS and OS to chemotherapy according to Scribble expression

2.6 BIM联合Scribble预测化疗效果

本研究入选的96例患者中，BIM基因野生型且Scribble高表达（BIM-WT-Scrib-H）组有27例，BIM基因野生型或Scribble高表达（BIM-WT/Scrib-H）组有62例，BIM基因缺失型且Scribble低表达（BIM-del-Scrib-L）组有7例。BIM-WTScrib-H组的中位PFS优于BIM-WT/Scrib-H组和BIM-del-Scrib-L组（10.0个月vs4.5个月vs2.0个月，P＜0.001，图5）；BIM-WT-Scrib-H组的中位OS长于BIM-WT/Scrib-H组和BIM-del-Scrib-L组（24.0个月vs9.5个月vs13.3个月，P=0.001，图5）。BIM-WT-Scrib-H组的ORR优于BIM-WT/Scrib-H组和BIM-del-Scrib-L组（62.9%vs29.0%vs14.3%，P=0.004）；BIM-WT-Scrib-H组的DCR与BIM-WT/Scrib-H组和BIM-del-Scrib-L组的差异无统计学意义（85.1%vs 69.3%vs42.9%，P=0.066）。

2.7 多因素回归分析

多因素回归分析结果显示，BIM基因缺失是晚期NSCLC化疗具有更短PFS的独立预测因素（HR=3.221，P＜0.001），Scribble低表达是晚期NSCLC化疗具有更短PFS的独立预测因素（HR=3.312，P＜0.001）；其余均为非独立预后因素（表2）。

图5 BIM联合Scribble与化疗PFS和OS的关系Fig.5 Kaplan-Meier curves of PFS and OS to chemotherapy according to BIM polymorphism combined with Scribble expression

表2 多因素分析Tab.2 Multivariate analysis

3 讨 论

BIM基因多态性对NSCLC的EGFR-TKI疗效预测价值已得到证实，但BIM基因多态性与晚期NSCLC化疗效果的关系研究较少，结果存在差异与不足。Lee等［14］的研究通过多因素分析得出，BIM基因缺失是化疗PFS和OS不佳的独立预测因素。而Zhong等［18］的研究结果显示，BIM基因缺失是EGFR突变型NSCLC使用含铂方案或培美曲塞化疗PFS不佳的预测因素，但无法预测EGFR野生型患者化疗的PFS，也无法预测患者的OS。上述研究均未将一线化疗与后线化疗分开，也存在含铂双药方案与单药方案混合分析的问题。

本研究入组病例不存在化疗方案及时机的差异，均为一线接受含铂双药化疗的晚期NSCLC患者，且临床基线特征无差异。结果显示，BIM基因缺失型是晚期NSCLC化疗PFS不佳的独立预测因素；预测价值不受EGFR突变状态影响。但BIM基因多态性不影响患者OS，可能与后线治疗差异较大，如放疗、免疫治疗等，也有可能与病例数不足有关。

本研究中Scribble高表达组的EGFR突变率高于低表达组，可能与回顾性研究配对不佳有关，Scribble表达与EGFR突变的相关性有待进一步验证。Scribble高表达组的化疗PFS、OS及ORR均优于低表达组；且多因素分析显示，Scribble低表达是化疗预后不佳的独立预测因素。上述结果与Wang等［16］的研究结果相仿，该研究首次在临床病例上证实Scribble与肺癌化疗效果的相关性。但Scribble高表达组的中位PFS为5.5个月，较既往研究报道的NSCLC化疗中位PFS无明显优势。因此我们决定探讨联合多种生物标志物提高化疗效果预测的可行性。

有研究表明，化疗是通过促进凋亡来杀死肿瘤细胞［19］，而BIM基因和Scribble蛋白均是参与细胞凋亡的重要介质［12，15］。既往研究表明，BIM可能通过ERK信号转导通路影响铂类药物敏感性［20］，Scribble是通过调节Nox2/ROS和Nrf2/PD-L1信号转导通路来调节铂类药物敏感性［16］。本研究同时检测BIM基因多态性和Scribble表达，并联合分析预测NSCLC化疗效果。

根据BIM基因和Scribble表达不同，将入组病例分为3组。其中BIM-WT-Scrib-H组的患者化疗PFS、OS及ORR均优于BIM-WT/Scrib-H组和BIMdel-Scrib-L组。BIM-WT-Scrib-H组的PFS长达10.0个月，OS为24.0个月，明显优于BIM基因野生型的PFS（5.0个月）和OS（11.6个月），也优于Scribble高表达的PFS（7.0个月）和OS（19.5个月）。由此可见，BIM基因和Scribble联合分析对化疗预测价值优于单个预测因素，而且BIM基因多态性和Scribble表达检测方法具有快速、简便、经济等优势，有助于化疗个体化应用的开展。

总之，BIM基因缺失型和Scribble低表达是晚期NSCLC化疗效果不佳的独立预测因素；两者联合应用有更好的预测价值，有利于肺癌的个体化治疗。但本研究为回顾性研究，且样本量有限，有待进一步深入研究提供更高级别的循证医学证据。