利用荧光标记SSR 鉴定西瓜杂交种的纯度研究

程维舜，罗茜，洪娟，王素萍，黄翔，杜雷，姜利，张利红，陈钢

（武汉市农业科学院环境与安全研究所，湖北武汉 430074）

西瓜（Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai）是葫芦科西瓜属重要的经济作物，原产于非洲南部[1-2]，瓜瓤脆嫩，味甜多汁，营养价值高，富含多种矿物质和维生素，在全球范围内被广泛种植。目前，我国每年西瓜种植面积和产量均居世界第一位，据FAO 数据统计，2018 年我国西瓜栽培面积149.91 万hm2，总产量6 153.69 万t[3]。西瓜产业在调整农业结构、保持生产平稳发展和促进农民增收中发挥着重要作用[4]。

目前，我国西瓜制种完全实现杂种化，种子质量的核心指标就是杂交种的纯度，纯度鉴定对于保障良种销售收益和种植收益来说尤为重要。传统的西瓜杂交种纯度鉴定方法是将杂交种种植后，通过比较成株的形态学特征进行鉴定[5]，这种方法周期长、工作量大、难度大，且易受环境、季节因素影响导致结果准确性差，鉴定效果不理想。因此育种的专业性要求越来越强，而目前的田间表型鉴定愈发不适应现代农业的发展需要。随着现代农业技术的不断发展，特别是分子标记的快速发展，分子标记的应用将加速杂交种纯度的鉴定过程，而且鉴定过程不受环境和人为因素影响，甚至不需要特定的育种工作者。该技术不分时间，作物生长时期，多态性强，能在短时间内准确地反映出种子的真实性[6-7]。因此在品种鉴定及种子检测中具有良好的应用前景。

武农8 号是由武汉市农业科学院作物所培育的适合湖北省春季西瓜产区设施和露地种植的综合抗病性强、高产、优质杂交西瓜新品种（品种登记号为GPD 西瓜（2017）420128）。随着西瓜栽培面积的逐年扩大，为保证杂交种的质量，亟需开展杂交种纯度的快速鉴定试验。本研究采用荧光标记SSR 技术，利用基于西瓜全基因组序列开发出来的能够最大限度代表西瓜遗传多样性的23 对核心SSR 引物[8-9]，对西瓜新品种武农8 号的杂交种进行引物筛选和纯度鉴定，以期建立快速、准确的杂交种纯度的室内检测技术，为西瓜新品种的推广应用提供技术支撑和保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

武农8 号（F1）及其父本（W07-5）、母本（W07-3）种子均由武汉市农业科学院作物研究所提供。武农8 号系武汉市农科院作物所杂交选育成的优质、早熟、小果型西瓜新品种。植株长势强健，易坐果，耐裂，果实膨大快，单果质量1.43～2.06 kg。果实椭圆形，果皮绿色，覆墨绿色齿条，厚度0.54 cm，蜡粉轻；果肉红色，中心糖含量12.5%，边糖含量10%，肉质松脆细嫩，品质佳。生育期95 d，果实发育期27～31 d，适合各地春播大中棚早熟覆盖栽培。产量2 513 kg/667 m2左右，商品率高。

1.2 试验方法

1.2.1 西瓜种子全基因组DNA 提取

选择籽粒饱满的武农8 号及其亲本种子各100 粒，55 ℃温水浸种6 h，置于恒温种子催芽箱中28 ℃催芽，出芽后播种于营养钵中，待植株具2 片真叶时，用改良CTAB 法提取叶片中的DNA。将幼嫩真叶组织30～40 mg置于2.0 mL 预冷过的离心管中，迅速撒上约0.5 mg 的DIECA 晶体，加入液氮，用组织捣碎仪打碎样品成粉末状，加入700 μL、2%CTAB 预热缓冲液及0.5 mg 的活性炭，65 ℃水浴1 h，加入700 μL 氯仿-异戊醇混合液（24:1），混匀，12 000 r/min 离心10 min；吸取上清液加入预先装有700 μL 异丙醇的1.5 mL 离心管中，混匀后放入-20℃冰箱30 min，12 000 r/min 离心10 min；弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤两遍，自然条件下干燥后，加入100 μL ddH2O 溶解DNA，用微量分光光度计检测DNA 质量，-20 ℃保存留用。

1.2.2 SSR 分子标记的PCR 扩增与电泳检测

选择基于西瓜全基因组序列开发出来的能够最大限度代表西瓜遗传多样性的23 对核心SSR 引物进行引物筛选和多态性分析，23 对荧光引物由武汉擎科生物科技有限公司合成（表1），其他分子生物学相关试剂均购自TAKARA。

PCR 扩增反应体系及程序：在PCR 管中加入dNTP 0.25 mmol/L，正、反向引物各0.2 μmol/L，TaqDNA 聚合酶1.0 U，10×PCR 缓冲液（含Mg2+），武农8 号及其亲本基因组DNA 60 ng、灭菌双蒸水补充到15 μL，利用DNA 分析仪检测时使用荧光标记的引物；混匀后置于PCR 仪上进行扩增。PCR 反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共34 个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存待用。

PCR 扩增产物的毛细管电泳荧光检测分析：将待用的6-FAM 和HEX 荧光标记的PCR 扩增产物用超纯水稀释30 倍，TAMRA 和ROX 荧光标记的PCR 扩增产物稀释10 倍。分别将等体积的上述4 种稀释后的溶液混合，从混合液中吸取1 μL 加入DNA 分析仪专用深孔板中。板中各孔分别加入0.1μLLIZ500 分子量内标和8.9 μL去离子甲酰胺。将样品在PCR 仪上95 ℃变性5 min，取出立即置于碎冰上，冷却10 min 以上。瞬时离心10 s 后置于DNA 分析仪上。使用DNA 分析仪的片段分析软件，读出每个样品的等位变异大小数据。

1.2.3 SSR 分子标记的纯度鉴定

以父母本样品DNA 的特异峰作为对照，只有同时具有亲本特异峰的单株才可确定为武农8 号杂交种，否则为杂种；种子纯度按公式（1）计算。

表1 西瓜23 对SSR 核心引物Table 1 23 pairs of core primers in watermelon

1.2.4 田间形态鉴定

将取材后的西瓜植株按照编号顺序定植，参照小果型西瓜栽培技术进行管理，在坐果期和幼果期，根据果实的果型、皮色和条带特征逐株进行纯度鉴定，将标记鉴定结果与田间鉴定结果进行比较分析。

2 结果和分析

2.1 武农8 号SSR 特异性引物的筛选

将23 对引物在武农8 号及其父母两个亲本间进行扩增，结果发现表现“双亲互补型”共显性条带的引物仅有1 对（见上页图1），即BVWS01897。BVWS01897 在F1扩出的条带一条来自父本211bp，是一条来自母本242bp，为典型的“双亲互补型”条带，且条带较为清晰、无杂带，该引物可用于武农8 号杂交种的纯度鉴定。

2.2 武农8 号的SSR 纯度鉴定

利用筛选出来的SSR 引物BVWS01897 对100 株武农8 号西瓜植株进行纯度鉴定，SSR-PCR 扩增结果发现，99 个单株既具有母本特异峰也具有父本特异峰，是真正的杂交种，10 号单株不具有父本特异峰，有且仅有母本扩增特异峰，说明10 号单株为母本自交株（见图2），武农8 号杂交种的纯度为99%。

2.3 田间形态观察纯度鉴定

坐果期、幼果期至果实成熟期田间调查结果发现，母本W07-5 植株生长势中等，早熟，极易坐果。全生育期87 d，果实发育期27 d，高圆形，果皮绿色覆窄齿条带，果肉红色，瓤质细脆，纤维少，中心糖含量12%，果皮韧，皮厚0.5 cm 左右，单瓜质量1.0～1.5 kg。父本W07-3 植株生长势强，分枝力较强，早熟，易坐果，全生育期89 d，果实发育期28 d，长椭圆形，果皮绿色覆齿条，果肉浅红色，瓤质细脆，中心可溶性固形物13%，皮厚约0.4 cm，单果质量1.5～2.0 kg。武农8 号植株生长势较强，主蔓长3.8 m，主茎粗0.4～0.5 cm。叶片羽裂状，叶色绿。主蔓第一雌花着生节位第7～9 节，以后每隔4～6 节着生一朵雌花，花为雌雄同株异花。坐果能力强，果实发育天数27～31 d，果形指数1.29，果皮绿色覆齿条，外观亮丽。皮厚0.54 cm，果皮硬度达47.10 kg/cm2，不易裂果，不易倒瓤。果肉红色，肉质细、脆多汁，口感极佳，中心含糖量约12.5%，边糖含量约10%，单果质量1.43～2.06 kg。10 号植株与果实植物学形态与母本性状完全一致，其余植株果实与武农8 号典型特征吻合，短椭圆形，浅绿果皮覆盖深绿细齿条带，条带数11～14 之间。田间形态学鉴定结果与分子标记鉴定结果高度一致。

3 讨论

在西瓜杂交制种的过程中，母本和父本分别种植在不同区域，雌花开花前，母本需要人工去雄，开花期再授以父本花粉来完成杂交过程，从而产生杂交种。如果母本去雄不彻底或漏去雄，花粉就可能落到雌花柱头上产生自交种，极大地影响制种纯度。因此，西瓜杂交种必需进行种子纯度鉴定。首先，传统的大田形态学鉴定方法成本高、耗时久等诸多缺陷严重制约了西瓜产业的发展；其次，由于西瓜遗传基础较窄，蛋白质种类和同工酶位点都有限，很难区分亲缘关系很近的杂交种；第三，初代的RAPD 分子标记技术本身的重复性、稳定性不高，引物的多态性较低。因此，传统的大田形态学鉴定方法很难应用到西瓜杂交种纯度鉴定中[10]。基于PCR 技术的SSR 分子标记是第二代分子标记技术，具有多态性丰富、重复性好、共显性遗传等特点，广泛应用于农作物品种鉴定[11]。由于常规的SSR 标记聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法需要在每块胶上设置标准带型对照[12]，才能确定待检样品在泳道上的位置，但当待检样品在凝胶泳道上的位置与标准带型对照较远，且标准带型对照上相邻等位基因片段差异较小时，待检样品的等位基因类型就难以确定，那么对检测结果就有影响。而SSR 荧光标记毛细管电泳检测方法，依据待检样品目标峰的位置，与同一毛细管泳道的内标LIZ 比较，直接读出目标DNA 片段的准确大小，无需设置标准带型对照。显然与常规的凝胶电泳检测方法相比，荧光标记毛细管电泳检测数据更为准确。因此，笔者筛选的SSR 引物BVWS01897，能特异鉴定武农8 号及其亲本，本研究通过对23 对西瓜SSR 核心引物的筛选，发现1 对引物在武农8 号及其亲本间具有多态性，特异引物对武农8 号进行纯度鉴定的结果与大田鉴定结果高度一致，充分说明SSR 技术室内快速鉴定西瓜品种纯度是可行的。