不同浓度胰岛素对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响

张 琦，史文倩，段步婷，崔小珍，郭露露，张 昱，郑明学，白 瑞

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）

鸡球虫病是由9 种艾美耳球虫引起，侵入鸡肠上皮细胞引发的一种寄生性原虫病[1]。全世界每年因鸡球虫病造成的经济损失巨大[2]。其临床症状主要为血痢，肠道受损[3]。9 种鸡球虫中，以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的危害最大，主要侵害盲肠[4]。目前，大多研究者进行柔嫩艾美耳球虫体外研究时，主要用原代鸡肾细胞和肺上皮细胞作为细胞模型，而柔嫩艾美耳球虫真正的宿主细胞是盲肠上皮细胞[5]。因此，为了进一步研究柔嫩艾美耳球虫入侵和损伤机制，进一步研制阻断柔嫩艾美耳球虫入侵和损伤宿主细胞的药物，需要建立一个鸡胚盲肠上皮细胞（Chick embryo cecal epithelial cells，CECECs）的体外培养模型。

胰岛素是由胰岛B 细胞受到内源性或外源性物质（葡萄糖、核糖、胰高血糖素等）的调节，经过胞吐方式分泌的一种蛋白质类激素[6]。它的作用主要有增强合成代谢及生长发育、维持糖代谢稳态与能量平衡[7]。胰岛素是一种在一定浓度内可促进细胞生长的关键性生长因子，能够调节糖类、蛋白质的分解利用[8]，从而促进细胞的增殖分化[9]，是一些细胞合成培养基中必不可少的成分。目前，确认的胰岛素生物效应是通过调控活化细胞中的蛋白激酶、磷酸酶等级联反应来实现促进细胞增殖的功能[10]。胰岛素发挥生物效应的主要信号通路有2 条，一是Ras 途径，二是磷脂酰肌醇3 激酶通路[11]，其作用机制为：胰岛素和细胞膜上的胰岛素受体（IR）结合进而激活酪氨酸激酶的活性，使受体底物（IRS）磷酸化，募集含有SH2 功能域的信号蛋白，最终发挥调控细胞生长、分化的作用[12]。

本研究对体外生长的CECECs 加入不同浓度的胰岛素，观察该细胞生长状况，通过比较CECECs克隆形成率、生长曲线等指标，分析不同浓度胰岛素的作用，确定培养基生长因子的最佳浓度，以便更好地构建体外CECECs 生长模型。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 16 日龄SPF 鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.2 试剂 DEME/F12 培养基、谷氨酰胺、0.25%胰酶 -EDTA 均购自 Gibco公司；角蛋白 18（CK-18）、DAB 显色剂、表面生长因子（EGF）、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma 公司；胰岛素、氢化可的松、青链霉素混合液、嗜热菌蛋白酶均购自Biolegend公司；纤连蛋白、肝素钠、MTT 试剂盒、PBS、0.4%台盼蓝、丙氨酸钠均购自Solarbio 公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；山羊血清、羊抗鼠IgG均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鸡胚盲肠上皮细胞的分离和原代培养 取16 日龄的SPF 鸡胚，在无菌条件下分离盲肠，去除肠系膜及周围结缔组织，用含双抗PBS 缓冲液漂洗5 次，每次3 min。剪成约1 mm3组织块，置于50 μg/mL 的嗜热菌蛋白消化酶中，并将其置于振荡培养箱（37 ℃，80 r/min）中恒温振荡消化2 h。待消化完成后，置于低温离心机中1 000 r/min 离心5 min。弃去上清，将沉淀在含10%胎牛血清的细胞培养基中重悬，轻轻吹打混匀，然后将细胞悬液接种于细胞培养瓶内，41 ℃，8%CO2的培养箱中培养70 min，贴壁差便于去除成纤维细胞。收集细胞培养液，1 000 r/min 离心5 min，沉淀在含2.5%胎牛血清的细胞培养基中重悬，并计数，按20 万/孔的细胞接种于细胞培养板中，将培养板置于41 ℃，8%CO2的培养箱中培养，每2 d 换液一次[13]，倒置荧光显微镜对细胞进行观察拍照。

1.2.2 胰岛素对鸡胚盲肠上皮细胞克隆形成率的测定 将长势较好、处于对数生长期的细胞先用0.25%的胰蛋白酶-EDTA 消化，然后将细胞悬液接种于2.5%的胎牛血清培养基中。设置每组胰岛素的质量浓度分别为 5、10、15、20 μg/mL，并设置对照组胰岛素质量浓度为0 μg/mL，每一个浓度设置3 个孔。各组以50、100、200 个细胞的梯度倍数稀释悬浮液分别接种于10 mL 培养皿中，轻轻转动培养皿使细胞分布均匀，置于 CO2培养箱（41 ℃，8%CO2）中培养14 d。每天观察培养皿中细胞的生长状况，当观察到有明显的细胞克隆现象时，停止对细胞的培养，将上清液吸弃至废液缸，再用PBS 冲洗贴壁细胞2 次，用4%的甲醛固定15 min，弃去固定液，然后用姬萨姆染色液染色20 min，流动水冲洗掉染色液，自然风干。倒置培养皿并在培养皿上加一张透明的网格纸，在显微镜下观察，计数大于10 个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。

1.2.3 鸡胚盲肠上皮细胞生长曲线（率）的测定分别将不同浓度胰岛素配制鸡胚盲肠上皮细胞生长的培养基，用96 孔细胞培养板每孔接种2×104个细胞，进行孵育培养，连续8 d 用MTT 法测定细胞活力，取3 组平行数据，用酶标仪于490 nm 处测定吸光度值，并根据测定结果绘制各组盲肠上皮细胞的生长曲线。

1.2.4 上皮细胞角蛋白18（CK-18）鉴定 将原代的鸡胚盲肠上皮细胞悬液接种于铺有细胞爬片的6 孔板中，41 ℃，8%CO2条件下培养，待细胞贴壁率为80%时，用PBS 缓冲液冲洗已爬片的细胞3 次。用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗涤3 次；室温滴加山羊血清处理20 min；加入CK-18 一抗，37 ℃孵育2 h，PBS 洗涤3 次；然后加入羊抗鼠二抗，避光37 ℃孵育 1 h，PBS 洗涤 3 次；DAB 显色，PBS 洗涤3 次。苏木精复染，封片。显微镜下观察染色结果。

1.3 数据处理

试验数据用SPSS Statistics v25.0 统计学软件进行单因素ANOVA 方差分析，结果均用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 鸡胚盲肠上皮细胞的形态学观察

在CECECs 培养基中加入不同浓度的胰岛素，培养72 h 后在倒置显微镜下观察上皮细胞。培养基中不添加胰岛素时，视野下细胞数较少且呈圆形，细胞散在分布（图1-A）。添加5 μg/mL 的胰岛素时，细胞数量增多，聚集生长呈岛屿状分布，少数细胞呈散在分布（图1-B）。添加10 μg/mL 的胰岛素时，细胞数量显著增多，密度增加，细胞之间紧密连接，均匀分布（图1-C）。添加15 μg/mL 的胰岛素时，细胞数量减少，聚集成岛屿状的细胞减少，呈散在分布，细胞呈圆形或椭圆形（图1-D）。添加20 μg/mL的胰岛素时，细胞数量显著增多，多数呈聚集分布，少数散在分布（图1-E）。培养7 d，CECECs 呈典型的鹅卵石样（图1-F）。

2.2 胰岛素对CECECs 克隆形成率的测定结果

由图2 可知，与不添加胰岛素组（CK）相比，5 μg/mL 的胰岛素对鸡胚盲肠上皮细胞克隆形成有明显促进作用。胰岛素在10 μg/mL 时，盲肠上皮细胞克隆形成效果最显著，细胞增长形成率明显增高，差异达极显著（P＜0.01）。胰岛素在 15 μg/mL 时，盲肠上皮细胞克隆形成率略有增高，但与10 μg/mL组的细胞克隆形成率间差异不显著（P＞0.05）。胰岛素在20 μg/mL 时，盲肠上皮细胞克隆增长率依然略有增高，但与15 μg/mL 组间差异不显著（P＞0.05）。因此，10 μg/mL 是促进细胞克隆形成的最佳质量浓度。

2.3 鸡胚盲肠上皮细胞生长曲线的测定结果

从图3 可以看出，体外培养的鸡胚盲肠上皮细胞，各组细胞1～2 d 生长缓慢，第3 天开始进入倍增生长期，添加胰岛素 10、15、20 μg/mL 组生长至第5 天达到细胞平台期，之后生长较为缓慢，且组间差异不显著（P＞0.05）。但与不添加胰岛素组（CK）、5 μg/mL 胰岛素组间差异达极显著 （P＜0.01），细胞生长活力旺盛。

2.4 鸡胚盲肠上皮细胞CK-18 免疫细胞染色结果

采用免疫细胞染色法鉴定分离培养的细胞中CK-18 的表达，结果显示（图4），细胞呈上皮细胞特有的角蛋白阳性。说明本试验分离得到的细胞表达了CK-18，具有上皮细胞的典型特征，表明生长克隆的细胞为CECECs。

3 结论与讨论

胰岛素是一种具有同化作用的生长因子，是细胞分裂和代谢的重要调节因子。胰岛素能够促进蛋白质的合成以及葡萄糖的氧化分解，释放能量供机体利用，从而刺激细胞的增殖分化[15]。胰岛素对DNA、RNA、ATP 的合成有促进作用[16]，有利于细胞的生长。GUNAWARDANA 等[17]研究表明，添加胰岛素能够减少凋亡和促进增殖，但同时存在剂量依存性。谢明权等[18]研究表明，胰岛素具有促进原代鸡肾细胞的生长和促进球虫卵囊形成的作用。于宇翔等[19]研究表明，胰岛素样生长因子（IGF-I）能够调节RNA 和DNA 的合成，促进小鼠睾丸间质细胞增殖和分化。在本试验中，在体外培养基中加入了不同浓度的胰岛素培养孵育72 h，随着胰岛素浓度的增加，鸡胚盲肠上皮细胞的增殖效应和克隆形成率也逐渐增加。当胰岛素质量浓度为10 μg/mL 时，盲肠上皮细胞的增殖效应最显著，细胞克隆形成率最高。与 10 μg/mL 组相比，虽然 15、20 μg/mL 组的细胞克隆形成率有所增高，但差异不显著（P＞0.05）。因此在本研究中，10 μg/mL 胰岛素是促进鸡胚盲肠上皮细胞生长增殖的最佳质量浓度。这为进一步研究鸡球虫对鸡盲肠侵害的机制有很大帮助。

CK-18 是一种特异性骨架蛋白，存在于上皮细胞表面[20]，对于维持上皮组织的完整性及连续性起着重要作用[21]。研究表明，CK-18 具有高度的保守性和组织分化特性，与上皮细胞的增殖分化密切相关[22]。CK-18 作为上皮细胞表面的特异性蛋白质，常被用于检测上皮来源的细胞[23]。尹博文等[24]通过细胞角蛋白免疫荧光染色鉴定，确定得到了树鼩小肠上皮细胞。洪智敏等[25]选用鼠抗鸡CK-18 单克隆抗体对培养的上皮细胞进行免疫组化鉴定，确定所培养的细胞为鸡胚小肠上皮细胞。本研究中，利用CK-18 免疫细胞染色法鉴定培养的细胞呈阳性，确定为CECECs，且具有上皮细胞的典型特征。

本研究结果表明，一定浓度的胰岛素可以促进鸡胚盲肠上皮细胞的增殖和生长。通过对该细胞克隆形成率和细胞生长曲线的测定发现，10 μg/mL 的胰岛素对鸡胚盲肠上皮细胞生长有显著的促进作用，并且用免疫细胞染色法鉴定本试验中培养的细胞为鸡胚盲肠上皮细胞。这为建立一个完善的体外鸡胚盲肠上皮细胞培养体系以及进一步研究鸡球虫的损伤机制奠定了基础。