烟草中异源表达谮茄HQT基因对多酚物质合成的影响

丁香玉 王鹏伟 储昭辉 赵翔宇 丁新华 李洋

摘要：羟基肉桂酰辅酶A：奎尼酸羟基肉桂酰转移酶Iydroxycinnamoyl-COA：quinate hydroxycinnamoyltransferase，HQn）是催化茄科植物咖啡酰奎尼酸生物合成最后一步的关键酶。为培育富含多酚物质的烟草，提高烟草品质，通过克隆番茄FQT基因，构建P35：SHOT超量表达载体，在野生型三生烟草（SS）中异源表达，利用高效液相色谱技术（HPLC）及液质联用（ILC-MSMS）技术对转基因烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸及黄酮醇含量进行检测，探究SHQT基因对三生烟草一咖啡酰奎尼酸及黄酮醇物质合成的影响。结果显示，转SQT烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸总含量最高可提高14.98倍，芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高可分别提高1.47和9.32倍，且生长表型与野生型烟草没有明显差异;转SIHOR基因烟草叶片中有4种（1-CQA，3-CQA，4-CQA，5-CQA）一咖啡酰奎尼酸，野生型烟草叶片中只检测到3种（3-CQA，4-CQA，5-CQA）SIHOT基因在烟草中的异源表达促进了1-CQA的生物合成且提高了一咖啡酰奎尼酸总含量，同时增加了黄酮醇的生物合成。

关键词：烟草;番茄OT基因;一咖啡酰奎尼酸;1-CQA;黄酮醇

酚类物质是烟草次生代谢的主要产物，与烟草品质紧密相关，对烟草的生长发育、抗逆性、色泽、香气质等方面有重要影响。其中，一咖啡酰奎尼酸和黄酮醇是烟草中重要的多酚物质，二者含量可达总酚量的80%以上。

一咖啡酰奎尼酸是烟草、番茄、马铃薯、苹果等植物中重要的苯丙酸，能够帮助植物细胞抵御低温、紫外线等各种非生物胁迫以及病原、害虫侵害5。根据咖啡酰基在奎尼酸上的结合位置不同可分为4种异构体：1CQA、3-CQA、4-CQA和5-CQA（CGA，綠原酸）。在植物生长发育过程中，CGA能够通过增强植物清除活性氧的能力，帮助植物抵御逆境。黄酮醇作为植物重要的苯丙烷类物质，广泛存在于烟草、番茄、马铃薯等茄科作物中，黄酮醇类物质参与植物生长发育的许多方面，如植物与微生物互作、紫外线防护、花粉生长和抵御害虫侵害等。

羟基肉桂酰辅酶A：奎尼酸羟基肉桂酰转移酶HQT，是多种作物咖啡酰奎尼酸合成的最后一步关键酶，将咖啡酰辅酶A和奎宁酸催化形成绿原酸。在蒲公英中超量表达Tahor可使叶片CGA水平升高82.49%，而RNA干扰使叶片CGA水平降低51.48%;超量表达LMHOT使忍冬中CGA含量提高2-3倍川;RAJA在马铃薯中通过RNAi对HOT的抑制导致CGA下降909%以上;RICARDAL刚将HOT在番茄中超量表达使CGA含量提高10%，RNAi沉默HQT后番茄叶片中CGA含量降低98%;结果均表明HOT基因是CGA合成的关键基因且正向调控绿原酸的生物合成。SHOT基因在番茄中调控绿原酸的合成，但对芦丁和山奈酚芸香糖苷的合成调控功能尚不清晰。因此，本研究以番茄中CGA合成的关键酶SOT为对象，分析番茄SIHOT基因在烟草中异源表达对烟草咖啡酰奎尼酸和黄酮醇生物合成的影响，为增加烟草中次生代谢物质含量，提高烟草品质及抗逆能力提供参考。

1材料与方法

1.1材料

番茄植株于山东农业大学温室大棚种植（2019年5-8月），生长条件为：白天25～28℃，夜晚15～18℃，土壤相对湿度为（7010）%。生长至果实成熟期，摘取果实，取果皮液氮急速冷冻，-80℃超低温冰箱保存备用。

三生烟草（SS）于山东农业大学作物生物学国家重点实验室植物培养室种植（T0代转基因株系及野生型种植于2019年10-12月，T1代转基因株系及野生型种植于2020年2-4月），生长条件为：25℃，16h8h光暗周期，相对湿度为（70：10）%。番茄品种Micro om种子，三生烟草（SS）种子，大肠杆菌EscherichiacoliDH5a，农杆菌LBA4404和真核表达载体PCXSN均由本实验室保存提供。

1.2方法

1.2.1SOT基因克隆和表达载体构建采用

Plant RNA Kit（OMEGA，美国）提取番茄果皮总RNA，根据反转录试剂盒（TOYOBO，日本），以番茄果皮总RNA为模板反转录获得CDNA，置于20℃保存。

以上述反应得到的cDNA为模板，根据番茄HOT基因序列（Genebank AJ582652），设计引物，序列为SOTF：5-ATGGGAAGTGAAAAAATGA-3，SIHOT-R：5-AATTTGTGTTGTACATTCTTGAT-3'。以cDNA为模板，利用高保真KOD酶（TOYOBO，日本）进行片段扩增，扩增到目的条带后切胶回收。回收纯化后SHOT基因片段和实验室保存的表达载体PCXSN，用XcmI（NEB，美国）分别进行酶切，纯化后将载体和目的基因片段用T4DNA连接酶（ThermoFisherScientific，美国）进行连接，构建遗传转化载体P35S：SHQ7。重组载体热激转入大肠杆菌DHSa，以35s启动子内部序列设计的引物35Ss-F：5-ACGCACAAICCCACTATCCTT-3'和基因内部序列设计的引物SIHOT-R5-AATGTGTGTACATCTGA-3，挑取单克隆进行菌落PCR检测，选择阳性克隆过夜扩繁，提取质粒送至华大基因股份有限公司（深圳）测序。经测序无误后，转化农杆菌LBA4404。

1.2.2农杆菌介导的烟草遗传转化及阳性检测选取烟草叶片作为外植体，采用农杄菌介导的叶盘转化法叫，将重组载体P35S：ST转化三生烟草受体材料。采用CTABI]法提取转基因植株叶片基因组DNA，进行PCR阳性检测。待生根培养基中烟草根系发育良好时，移栽到营养钵中于培养室生长。在T0代阳性植株中随机选择3个株系，编号为SOT-1，SHQT-2和SHOT-3，收取种子后进行T1代种植。每个株系取3棵生物学重复，进行半定量检测，验证遗传稳定性。

1.2.3一咖啡酰奎尼酸和黄酮醇物质提取和含量测定待烟草叶片生长至8叶期，取中部3片真叶进行检测。参照文献[1-18]，对转基因和非转基因烟草叶片进行含量检测和质谱分析，取10L过滤液用于HPLC检测，5uL用于LC-MSMS分析标准品为芦丁（Sigma），一咖啡酰奎尼酸（Sigma），山奈酚芸香糖苷（Extrasynthese）。T0代烟草每株重复检测3次;T1代烟草每个株系3个生物学重复。

2结果

2.1ST基因克隆和基因表达载体构建

按照番茄中SOT的已知序列设计引物，以番茄果皮cDNA为模板，通过PCR扩增获得长度为1293bp的清晰目标序列（图1A）;构建P35：SHOT，挑取单克隆利用35-F、SIHOT-R引物进行PCR阳性验证（图1B），选取3个阳性克隆过夜扩繁后提质粒测序。

将测序结果与目标序列Sihor（GenebankAJ582652）比对，二者序列比对一致，确认成功克隆SHOT的完整基因序列，并成功构建P3S：SHOT载体。

2.2SQT基因遗传转化和转基因烟草的获得

对转基因烟草进行阳性检测（图2），在获得的9株转基因材料中，有7株扩增到了目标基因序列，确认为阳性转基因植株，转化率为77.7%。

2.3烟草叶片一咖啡酰奎尼酸和黄酮醇物质含量

HIPLC检测结果显示（表1、图3），转SIHT基因的烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸、芦丁、山奈酚芸香糖苷的含量都有不同程度的提高。其中，一咖啡酰奎尼酸的含量提高了797～14.98倍，最高含量达4598.17ugg。芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高分別可达265.08和175ugg，分别是相同条件下野生型三生烟草（SS）叶片中含量的9.58倍和8.71倍。

對T1代植株进行半定量检测，结果表明（图4）转基因烟草中SFQT基因表达量较高，而野生型中没有基因表达，说明转基因阳性的真实性和遗传稳定性。并且转基因烟草T1代植株3种物质含量都有不同程度的提高，说明转SHOT基因烟草富含一咖啡跣奎尼酸及黄酮醇的优势可以稳定遗传（图5、表2）。

2.4烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸质谱分析

质谱分析结果显示（图6，表3），在野生型烟草叶片中，检测到3-CQA，4-CQA，5-CQA三种咖啡酰奎尼酸，而在转SIHOT基因烟草叶片中检测到1-CQA，3-CQA，4CQA，5-CQA四种一咖啡酰奎尼酸（图7，表4）。

3讨论

本研究将番茄中的QT基因连接35s启动子构建真核表达载体，在野生烟草中异源表达，烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸含量明显提高，说明番茄中的HT基因能在烟草中正向调控一咖啡酰奎尼酸的生物合成，提高一咖啡酰奎尼酸含量，这与RICARDA1、ANDREA等的研究结果基本一致。番茄SHQT与烟草MHT编码的蛋白质序列相似性分别高达91%，在植物体内行使相同的功能，都是将咖啡酰辅嗨A和奎宁酸催化形成绿原酸，正向调控绿原酸的生物合成。

另外，转SIOT基因烟草与野生型相比，多检测到一种一咖啡酰奎尼酸（1CQA），在番茄中存在4种一咖啡酰奎尼酸，而在野生型烟草中仅检测到3种，可能与SHQT和MHOT编码的蛋白序列差异有关，后者在225-229位置缺少苏氨酸（T）、丝氨酸（S）、脯氨酸（P）、赖氨酸（K）、脯氨酸（P）5个氨基酸，导致咖啡酰基在奎尼酸的1号位不能结合，不能形成1-CQA;也可能是因为野生型烟草叶片中1-CQA含量极低，未达到检测线，而转基因烟草叶片中，SIHOT基因的异源表达促进一咖啡酰奎尼酸的大量合成，1-CQA含量升高，达到检测线。而本研究中高效液相色谱技术未分离出4种咖啡酰奎尼酸的单峰，可能与流动相配比和酸浓度有关。

SHHOT基因在番茄中调控绿原酸的合成，并且随着果实成熟，表达量提高，但对芦丁和山奈酚芸香糖苷的合成调控功能还未有明确报道。此次试验将番茄中HOT基因在三生烟草上表达分析，对T0代和T1代转基因烟草叶片进行一咖啡酰奎尼酸和黄酮醇含量检测，发现转基因烟草代谢物质含量增多的表型能够稳定遗传，但是含量差异较大，猜测烟草的生长状态对次生代谢物质积累具有较大影响。除一咖啡酰奎尼酸外，烟草中芦丁和山奈酚芸香糖苷含量也有明显提高。这几种多酚物质合成路径共享多种中间酶和前期次生代谢物，都是以苯丙氨酸为合成底物，经过PAIL（L-苯丙氨酸解氨酶）C4H（肉桂酸羟化酶）、4CL（p-香豆酰CoA合成酶）催化合成p-香豆酸辅酶A。然后以p-香豆酰辅酶A为底物，通过多种酶分别催化合成一咖啡酰奎尼酸，芦丁和山奈酚芸香糖苷等。结合试验结果，推测HT基因的超量表达可能激活一咖啡酰奎尼酸合成路径中上游的PAL、C4H、4CL酶，增加前期代谢物质萃丙氨酸和p-香豆酸辅酶A的积累，这些合成相关酶及代谢物质的增多，同时促进下游多种黄酮醇合成酶的反应，从而更强地激活芦丁和山奈酚芸香糖苷合成路径，而这些黄酮醇合成途径中关键酶基因的表达变化情况有待进一步研究。

4结论

将SOT在烟草中异源表达发现，HQT基因正向调控烟草中一咖啡酰奎尼酸的合成，也促进烟草中芦丁和山奈酚芸香糖苷的积累。转SHOT基因烟草叶片中一咖啡酰奎尼酸种类比野生型烟草叶片中多一种（1-CQA），且总含量最高可提高14.98倍，达4598.17ugg，芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高可分别提高11.47和9.32倍。转SHQT基因没有影响植株的正常生长发育。这几种多酚物质含量提高有助于提高烟草抵抗胁迫能力，增加香气量，提高烟草品质，为烟草品质育种和多用途开发利用提供研究基础。

参考文献

[1]朱小茜，徐晓燕，黄义德，等.多酚类物质对烟草品质的影响安徽农业科学，2005，33（10）：132-133

[2]杨虹琦，周冀衡，邵岩，等.不同产地烤烟叶中绿原酸和芸香苷的含量分析.天然产物研究与开发，2006，18（4）：670-673

[3] CLIFFORD M N. Chlorogenic acids and other cinnamates-nature， occurrence， dietary burden， absorption and metabolism [J] Journal ofthe Science of Food &Agriculture， 2000， 80（7）： 1033-1043

[4] UPADHYAY R， MOHAN R L J An outlook on chlorogenic acids occurrence， chemistry， technology and biological activities [J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2013. 53（9968-984.

[5]王玲娜，姚佳歡，马超美.绿原酸的研究进展[J].食品与生物技术学报，2017，36（11）：1121-1130

[6] CLE C， HILL L M， NIGGEWEG R， et al. Modulation of chlorogenic acid biosynthesis in Solanum lycopersicum： consequences forphenolic accumulation and UV tolerance [J]. Phytochemistry， 200869（11）：2149-56

[7] LI Y， TANG W Z， CHEN J， et al. Development of marker-free transgenic potato tubers enriched in caffeoyl quinic acids andflavonols [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2016，64（14）：2932-2940

[8] GRACE S C， LOGAN B A. Energy dissipation and radical scavengng by the plant phenylpropanoid pathway[J]. Biological sclences，2000，355（1402）：1499-1510

[9] WANG S L， CHU Z H， JIA R， et al. SIMYB12 regulates flavonol synthesis in three different cherry tomato varieties [J]. Scientifi Reports，2018，8（1）：1582

[10] LIU Q， LIU Y， XU Y， et al. Overexpression of and RNA interference with hydroxycinnamoyl-coa quinate hydroxycinnamoyl transferaseaffect the chlorogenic acid metabolic pathway andenhance saaittolerance in Taraxacum antumngense Kitag J]. Phytochemistry Letters2018，（28）：116-123

[11]CHEN Z， LIU G， LIU Y， et al. Overexpression of the IMHO/ gene increases chlorogenic acid production in Lonicera macranthoides Hand-mazz[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2017， 39（1）： 27

[12] RAJA S P， ROSHANI S， VENKATESAN G S， et al. Synthesis and regulation of chlorogenic acid in potato： Rerouting phenylpropanoidflux in Hqt-silenced lines[J]. Plant Biotechnology Journal， 201513（4）：551-564.

[13] NIGGEWEG R， MICHAEL A J， MARTIN C Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid [J]. Nature Biotechnology， 2004， 22（6）： 746-754

[14赵莉，钟鸣，马慧，等，农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立.江苏农业科学，2011，39（3）：67-68

[15] POREBSKI S， BAILEY L G， BAUM B R Modification of CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharideand polyphenol components [J]. Plant Molecular Biology Reporter1997，15（1）：8-15

[16] LI Y， CHEN M， WANG S L， et al. ATMYBLL regulates caffeoylquinic acid and flavonol synthesis in tomato and tobacco [J]Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2015， 122（2）： 309-319

[17] LUO J， BUTELLI E， HILL L， et al. ATMYB12 regulates caffeoylquinic acid and flavonol synthesis in tomato： expression irfruit results in very high levels of both types of polyphenol [J].The Plant Joumal，2008，56（2）：316-326

[18] CLIFFORD M N， JOHNSTON K L， KNIGHT S， et al. Hierarchical scheme for LC-MSN identification of chlorogenic acids [J] Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003.51： 2900-2911

[19] MOGLIA A， LANTERI S， COMINO C， et al. Dual catalytic activity of hydroxycinnamoyl-coenzyme a quinate transferase from tomatoallows it to moonlight in the synthesis of both mono-anddicaffeoylquinic acids [J]. Plant Physiology， 2014， 166（4177-1787

[20] MISRA P， PANDEY A， TIWARI M， et al. Modulation of transcriptome and metabolome of tobacco by Arabidopsistranscription factor， ATMYB12， leads to insect resistance [J]. Plant Physiology，2010，152（4）：2258-2268