枸杞多糖对重铬酸钾所致孕鼠生殖毒性的干预作用研究

李 杜，刘燕群，2△，杨 晔，甘维康，鲁雄兵，吴 倩，林可欣，管庆美

(1.江汉大学医学院，湖北 武汉 430056；2.江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，湖北 武汉 430056)

铬广泛存在于人类生存环境中，2017年10月27日WHO国际癌症研究机构公布的致癌物清单表明，金属铬(Cr)离子在3类致癌物清单中。除金属Cr外，最常见的价态是Cr6+和Cr3+。Cr6+可通过皮肤、消化道、呼吸道等方式进入人体，损害机体，且重铬酸钾(PD)对胚胎的生殖毒性已被相关研究证实[1]。

枸杞多糖(LBP)是枸杞子的主要成分之一，是我国传统中药素材，具有增强免疫力、抗癌、防衰老、降血压、降血糖、抑制肿瘤生长和细胞突变等作用[2]。有学者发现，LBP的抗氧化作用可能是其保护雄性生殖功能的机制之一[3]。也有研究表明，LBP具有一定的雄性生殖毒性的拮抗作用[4]。关于PD损害机制的研究较多，但对其损伤机制修复的研究较少[5]，而利用生活中常见的LBP来干预PD所致的孕鼠生殖毒性的研究鲜见报道。鉴于此，本研究选取雌性和雄性SD大鼠自然受孕，通过灌胃PD溶液制造孕鼠PD中毒模型，给予不同剂量LBP溶液干预PD染毒模型大鼠，运用微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定各组大鼠胎盘及血清Cr水平，初步探讨了LBP对PD致孕鼠生殖毒性的干预作用，本研究已通过本院伦理委员会批准。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 2018年7月选取SPF级SD雌鼠20只和SD雄鼠10只(购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：43004700047638)。大鼠毛发浓密有光泽，身体状况良好。将大鼠雌雄分开并置于室内(24±1)℃适应性喂养3 d后，将雌鼠随机分为10组待实验使用，每组2只，每组雌鼠平均体重为(255±25)g。

1.1.2主要实验仪器与试剂 LBP购于上海源叶生物科技有限公司，纯度大于90.0%；PD购于山东西亚化学股份有限公司，纯度99.8%；优级纯硝酸购于开封东大化工有限公司。JA2003B电子天平购于上海越平科学仪器有限公司；XD-202倒置生物显微镜购于南京江南永新光学有限公司；MD6C型微波消解仪购于北京盈安美诚科学仪器有限公司；iCAP Q型ICP-MS仪购于赛默飞世尔科技公司；离心机购于上海越平科学仪器有限公司等。

1.2方法

1.2.1动物模型创建与分组

1.2.1.1预实验 确定正式实验所用的重铬酸钾染毒剂量，将8只雌性大鼠分为对照组、低剂量PD(Cr6+)染毒组、中剂量PD染毒组和高剂量PD染毒组。低、中、高剂量PD溶液分别定为1/8半数致死量(LD50)、1/4 LD50、1/2 LD50。将大鼠按上述分组雌雄2∶1配种，每组雌鼠2只与雄鼠1只，正常喂食、喂水，并于每天早上对每只雌鼠做阴道涂片，与显微镜下观察到精子的雌鼠记为怀孕第0天。将这些雌鼠进行标记，PD染毒组于怀孕第3天开始灌胃根据分组所定不同剂量的PD溶液，对照组于怀孕第3天灌胃生理盐水。对照组及PD染毒组于PD染毒后6 h再次灌胃，均为100 mg/kg LBP溶液。参照文献[6]确定最佳染毒的灌胃时间，预实验拟连续灌胃7 d。

1.2.1.2正式实验 根据预实验结果，1/4 LD50的PD溶液对SD大鼠染毒效果较好，且大鼠存活率较高，故正式实验将PD染毒剂量定为1/4 LD50。将雌雄大鼠2∶1分为对照组(灌胃生理盐水)、PD染毒组、PD染毒给予低剂量(10 mg/kg)LBP组(PD+L-LBP组)、PD染毒给予中剂量(50 mg/kg)LBP组(PD+M-LBP组)、PD染毒给予高剂量(100 mg/kg)LBP组(PD+H-LBP组)和PD染毒给予更高剂量(200 mg/kg)LBP组(PD+MH-LBP组)。每组雌鼠2只与雄鼠1只。采用预实验的方法测定雌鼠怀孕第0天，于怀孕第3天开始灌胃，对照组灌胃生理盐水，PD染毒组、PD+L-LBP组、PD+M-LBP组、PD+H-LBP组、PD+MH-LBP组均灌胃1/4 LD50PD溶液。灌胃操作6 h后进行第2次灌胃操作，对照组、PD染毒组灌胃生理盐水，PD+L-LBP组灌胃10 mg/kg LBP溶液、PD+M-LBP组灌胃50 mg/kg LBP溶液、PD+H-LBP组灌胃100 mg/kg LBP溶液、PD+MH-LBP组灌胃200 mg/kg LBP溶液。根据预实验结果正式实验连续灌胃7 d。

1.2.2标本采集 各组雌鼠怀孕后每天称体重1次，观察其外观及生活状态。怀孕第19天使用水合氯醛麻醉孕鼠后于腹主动脉取血，装在未加凝血剂的采血管中静置20 min，随后3 000 r/min离心10 min。取血后按剖检顺序取下孕鼠肝、肾、胎盘等，用生理盐水稍加漂洗后吸干脏器表面水分，立即在感量为0.01 g电子天平上称重，脏器系数=脏器重量/体重。每只孕鼠取3份血清保存待测，每只孕鼠取10个胎盘保存待测。

1.2.3样品前处理 硝酸是ICP-MS分析中最好的酸介质，因硝酸中含有的氧、氮、氢3种元素，在等离子体所夹带的气体中均含有，不会再引入新的多原子离子干扰[7]。配置1%稀硝酸作为标准液。取0.1 mL血清加入1%稀硝酸4.9 mL定容成5 mL溶液。胎盘样品取每个与微波消解罐中加入10.0 mL优级纯硝酸以设定程序：90 ℃运行6 min、120 ℃运行9 min、140 ℃运行15 min进行消解。消解后于电热板中将多余硝酸赶至1.0 mL装于容量瓶中使用超纯水定容至50 mL。

1.2.4样品测定 点燃等离子体后仪器预热30 min至稳定，引入多元素混合调谐溶液调节ICP-MS各项参数，选择低、中、高质量数元素对ICP-MS灵敏度进行调谐，同时调节氧化物及双电荷等指标至满足测定要求，通过三通在线引入内标溶液，依次测定标准溶液、空白溶液和样品溶液[8]。

2 结 果

2.1各组孕鼠胚胎数比较 PD染毒组孕鼠胚胎数[(11±2)个]均明显少于对照组、PD+L-LBP组、PD+M-LBP组、PD+H-LBP组、PD+MH-LBP组[分别为(18±1)、(16±3)、(19±1)、(20±1)、(20±1)个]。

2.2各组孕鼠血清及胎盘Cr水平比较 PD染毒组孕鼠血清及胎盘Cr水平均明显高于对照组、PD+L-LBP组、PD+M-LBP组、PD+H-LBP组和PD+MH-LBP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 各组孕鼠血清Cr水平比较

表2 各组孕鼠胎盘Cr水平比较

3 讨 论

本研究探讨了LBP对PD生殖毒性的干预作用，结果显示，LBP对PD的生殖毒性具有一定的保护作用。本研究对孕鼠连续7 d的灌胃，使其胎盘产生不同梯度的Cr。结果显示，PD染毒组孕鼠胚胎数明显少于LBP干预的孕鼠及对照组，说明LBP可阻止PD引起的胚胎数减少。

胎盘Cr水平的增加表明Cr6+可透过胎盘屏障，其强氧化性可对胚胎发育造成影响[9]。本研究参照文献[10]采用微波消解-ICP-MS法测定了孕鼠血清及胎盘Cr水平，此方法具有操作简便、基体干扰小、准确度高、精密度高等优点[11]。本研究结果显示，PD染毒组孕鼠胎盘Cr水平均明显高于对照组、PD+L-LBP组、PD+M-LBP组、PD+H-LBP组和PD+MH-LBP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。给予LBP剂量越大的孕鼠胎盘Cr水平越趋近于对照组，说明LBP能改善Cr6+造成的胎盘损伤，表明LBP对PD所致的生殖毒性具有干预作用。

孕鼠血清Cr水平也有类似胎盘Cr水平的变化规律，给予LBP剂量越大的孕鼠血清Cr水平越趋近于对照组，与胎盘Cr水平呈剂量依赖性关系。胎盘正常功能和形态的建立对胚胎发育十分重要，与胎盘血流量和面积也息息相关，所以，与血清Cr水平变化也十分紧密，进一步说明了Cr可透过胎盘屏障作用于胎盘及LBP的强氧化性对PD的毒性具有干预作用。

HSIEH等[12]研究表明，Cr6+也可损伤卵黄囊，因Cr6+可穿过细胞膜，且具有强氧化性[13]，通过对卵黄囊上皮、间质和间皮层的损害导致卵黄囊功能紊乱。在胎盘循环建立前卵黄囊是胚胎与母体之间进行交换的基本源泉，具有提供营养、参与内分泌等功能，致畸物质常通过母体间接对胚胎发挥致畸作用，而卵黄囊在母体与胚胎间物质运输中具有关键防御作用[14]。LBP对PD所致的生殖毒性保护作用也可影响卵黄囊，与其强大的抗氧化能力有关[15]。但具体的保护机制和最适宜干预剂量尚需进一步研究和验证。