应用SSR分子标记鉴定新台糖25号×云蔗89-7 F1代大规模遗传群体的杂种真实性

赖小群，黄帝媛，姚潇，陈悦佳，姚姿婷，邹承武，陈保善

(1.广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004；2.广西甘蔗生物学重点实验室，南宁 530004；3.蔗糖产业省部共建协同创新中心，南宁 530004；4.广西大学农学院，南宁 530004)

0 引言

甘蔗（Saccharumspp.）是世界上最重要的糖料作物，全球食糖供应总量的85%以上来自甘蔗，而在我国这一比例高达90%以上[1-2]。杂交育种是现代甘蔗品种选育的主流方法，除可以将父母本优良性状进行组合外，还可能创造出超亲杂种优势[3]。

新台糖品种‘新台糖25 号’具有高产、高糖、高抗黑穗病和条锈病等优良特征[4-5]，而‘云蔗89-7’具有高产、高糖、抗倒伏、宿根性强、抗嵌纹病和褐条病等优良性状[6]。本研究团队利用‘新台糖25号’ב云蔗89-7’这对亲本组合杂交选育出的甘蔗新品种‘中蔗1 号’、‘中蔗6号’和‘中蔗9 号’，除了具有高产、高糖、耐寒和耐旱等优点外，在抗黑穗病方面特别突出，新植和宿根蔗的黑穗病发病率都低于0.1%[7]。在上述中蔗系列品种选育过程中，观察到‘新台糖25号’ב云蔗89-7’亲本组合的杂种后代除抗黑穗病性状外，其他主要农艺性状如蔗糖分、株高、蔗茎、分蘖、株形、成熟期以及抗梢腐病等，均呈现一定程度的变异性。为充分发掘和利用‘新台糖25 号’和‘云蔗89-7’的优异基因资源，探究甘蔗抗/感黑穗病和梢腐病机理，本研究再次以‘新台糖25 号’ב云蔗89-7’这对亲本组合进行有性杂交，通过构建大规模遗传群体来筛选特定性状的遗传亚群体，以便为今后利用多组学技术阐明甘蔗重要农艺性状形成的分子基础提供研究材料。

甘蔗是雌雄同株高度杂合的异源多倍体植物，在杂交育种过程中如果母本去雄不彻底，将会发生自交现象，导致F1群体出现真杂种和自交种混杂现象，因此有必要对杂交后代进行杂种真实性鉴定。本研究的目的是筛选出多态性好的父本特异性的简单串联重复序列（SSR）标记用于对‘新台糖25号’ב云蔗89-7’组合的F1代实生苗进行真假杂种的鉴定，为利用真杂种构建特定性状亚群体奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料：母本为‘新台糖25号’，父本为‘云蔗89-7’，杂交组合花穂购自海南甘蔗育种场。亲本及F1代实生苗种植于广西扶绥县广西大学亚热带农科新城甘蔗良种研发与繁育基地，常规管理。

供试药品和试剂：Tris-HCl、EDTA、氯化钾、丙烯酰胺、Tris 碱、硼酸、亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED)、氢氧化钠、硝酸银、四硼酸钠和甲醛等均为国产化学纯或分析纯等级。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA的提取

根据常规TPS 法[8]适当改进用于提取甘蔗总DNA。将约0.1 g 新鲜幼嫩叶片剪碎置于1.5 mL 离心管中，加入研磨珠和500µL TPS 缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、10 mmol/L EDTA（pH=8.0）、1 mol/L KCl]，置于研磨仪上，在振动频率为60 Hz（3 600 r/min）的条件下研磨60 s。75℃水浴20 min。12 000 r/min，离心l0 min。离心后，吸取200µL 的上清液加入到新的1.5 mL 离心管中并加入等体积异丙醇后混匀，4 000 r/min，离心，10 min。弃上清，在沉淀中加人120µL 的70%乙醇，4 000 r/min，离心5 min。沉淀置于室温下干燥，干燥后加入50µL ddH2O溶解，置于-20℃保存待用。

1.2.2 SSR-PCR扩增

SSR 引物PCR 反应体系总体积为20µL，每管包含10µL 2×Rapid Taq Master Mix，lµL 的模板DNA（15 ng/µL），上、下游引物各1 µL（10 pmolL）。在ABI ProFlexTM梯度PCR 扩增仪（新加坡，ProFlex 3×32 孔）上进行PCR 扩增，扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52～62 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环后再72 ℃延伸7 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离或8%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，变性聚丙烯酰胺凝胶经银染显影后，拍照保存。

1.2.3 特异性目的片段的克隆测序

将聚丙烯酰胺凝胶上的目的条带切下并捣碎，置于离心管中，加入适量超纯水浸泡过夜，然后12 000 r/min离心1 min，取上清液（含目标DNA）作为模板，用SMC31CUQ 引物再次进行PCR扩增。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分离，切取目的条带并用胶回收试剂盒回收目的片段，然后克隆到pEASY®-T1 载体并进行序列测定。TA克隆操作步骤详见pEASY®-T1 Cloning Kit试剂盒说明书（北京全式金生物技术有限公司）。DNA序列测定由生工生物工程（上海）有限公司完成。根据测序获得的DNA序列信息设计特异性检测引物。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

一对能在父本中扩增出区别于母本的特征带引物SMC31CUQ（图1），是筛选自54对SSR引物（表1）。再利用这对引物对‘新台糖25号’ב云蔗89-7’杂交F1代的部分实生苗进行PCR 检测，发现部分样本扩增出具有母本特征的3 条带（a，ROC25-1；b，ROC25-2 和c，ROC25-3），其余样本扩增出具有父本特征的4 条带（d，YZ89-7-1；e，YZ89-7-2；f，YZ89-7-3 和g，YZ89-7-4），其中g 片段为父本‘云蔗89-7’所特有（图2）。分别对这些PCR产物进行了回收、克隆和测序。序列比对发现，全部7个PCR产物带均携带完整的SMC31CUQ 引物序列SMC31CUQ-F 和SMC31CUQ-R，各产物序列具有高度同源性，是典型的重复性序列，但长度有所不同，主要表现为缺失，少量为插入突变（图3）。为简化鉴别程序和提高鉴定准确性，根据‘云蔗89-7’特有的g片段（YZ89-7-4，159 bp）序列设计了一个3′端巢式引物SMC31CUQ-1-R（图3），用其与SMC31CUQ-F 对父母本和部分F1代实生苗进行PCR 扩增，结果表明该引物对仅能从父本和SMC31CUQ 检测带有g 片段的F1代实生苗（图4A）特异性扩增出一个约100 bp的产物，且能够用普通琼脂糖凝胶电泳进行检测（图4B）。

图1 部分SSR引物扩增图谱Fig.1 Amplification results of some SSR primers

表1 本研究所使用的SSR 引物序列Table 1 Sequences of the SSR primers used in the test

图2 SMC31CUQ引物对亲本及杂交F1代的SSR检测结果Fig.2 The polymorphic bands of the primer SMC31CUQ for parents and its F1 progenies

图3 亲本的SMC31CUQ标记序列比对及SSR引物和特异性引物结合区域Fig.3 Sequence alignment of SMC31CUQ marker from parents and the binding region of SSR and specific primers

图4 用巢式SMC31CUQ-1-R进行亲本特征鉴定的特异性Fig.4 Specificity of nested primer SMC31CUQ-1-R on identification of parental characteristics

2.2 利用特异性SMC31CUQ-F/SMC31CUQ-1-R 引物对杂交后代进行鉴定

取杂交组合‘新台糖25号’ב云蔗89-7’的F1代遗传群体的苗期叶片提取DNA，使用引物SMC31CUQ-F/SMC31CUQ-1-R 进行PCR 扩增，从17 923 个样品中鉴定出9 310 株具有父本特征条带的子代，占总数的51.94%。

3 讨论与结论

甘蔗是无性繁殖作物，杂种优势可以在F1代得到固定和利用[16]。在甘蔗杂交育种中，亲本的选择应考虑基因遗传效应和自身表现[17]。由于甘蔗为异源多倍体植物，其杂交后代的基因自由组合和分离不一定符合孟德尔遗传定律，同时某些性状可能还受基因剂量调控，因此用遗传群体来研究甘蔗重要性状非常有必要。但要获得足够数量的单一性状遗传群体，首先要有大规模的F1群体。甘蔗颖花小，很难通过人工完全去雄，在甘蔗有性杂交育种过程中有可能发生自交，而且在杂交过程中也可能由于串粉而产生其他杂种材料，因此有必要对甘蔗杂交后代进行杂种真实性鉴定[18]。在现有的多种甘蔗杂种真实性鉴定方法中，分子标记方法可直接通过DNA 进行鉴定，操作方便，重复性好，结果准确。而在多种分子标记中，SSR 标记因具有共显性、高基因组覆盖度、多态性高和操作简单等优点，已开始用于甘蔗杂交后代的真实性鉴定[9，15,19-20]。

本研究从54 个来源于不同甘蔗种质资源的SSR 标记中筛选出能在杂交组合‘新台糖25 号’ב云蔗89-7’的F1代中扩增出父本‘云蔗89-7’特征性DNA 片段的SMC31CUQ 标记，并通过对所有父母本多态性片段的序列分析，成功建立了将父本特异性多态性片段转化为特异性PCR 产物的方法，极大简化了杂种鉴定程序。本研究发现整个遗传群体的51.94%（9 310株）携带父本标记，可确定为真杂种。然而，由于甘蔗杂交存在父本染色体丢失现象，目前尚不能排除余下48.06%的F1群体是否仍然含有一定比例的真杂种。未来新的特异性SSR标记或其他类型的标记，将可望从对杂交亲本的全基因组序列的对比分析中产生。

SSR标记SMC31CUQ能在甘蔗亲本品种‘新台糖25号’和‘云蔗89-7’扩增出有差异的多态性PCR 产物。基于对这些多态性PCR 产物的序列分析，新设计的SMC31CUQ-F/SMC31CUQ-1-R 引物对可在父本‘云蔗89-7’特异扩增出一个114 bp 的PCR 产物，而在母本‘新台糖25 号’不能扩增任何片段。用该引物对杂交组合‘新台糖25 号’ב云蔗89-7’的F1代遗传群体17 923 个单株进行检测，其中51.94%（9 310 株）携带该父本标记，可确定为真杂种，为甘蔗遗传图谱构建和重要性状的QTL定位等相关研究提供了可靠的材料。