珊瑚来源放线菌Streptomyces albidoflavus M13.1的次级代谢产物化学成分研究*

林玉坤，谢春兰，贾凌云，张改云，杨献文，潘英妮**

(1.沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳 110016；2.自然资源部第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验，福建厦门 361005)

0 引言

海洋放线菌是海洋微生物的重要组成部分，也是产生多种天然化合物的重要来源。链霉菌是海洋放线菌中研究最多的一个菌属，截至2016年从海洋链霉菌中分离得到的次级代谢产物有547个[1]，包括生物碱类、甾体类、萜类、聚酮类等化合物，其中生物碱类化合物是主要的结构类型。迄今为止，大多数链霉属放线菌是从海洋沉积物中分离得到的，而从珊瑚中分离到的链霉属放线菌次级代谢产物研究鲜有报道。本研究通过对珊瑚来源的链霉属放线菌次级代谢产物进行研究，丰富珊瑚来源的链霉属放线菌次级代谢产物的结构类型，为进一步研究和开发珊瑚来源链霉属放线菌的化学成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和试剂

旋转蒸发仪(N-1100，上海诶朗科技有限公司)，核磁共振仪(Bruker Avance Ⅱ 400 MHz)，高分辨质谱仪(Waters Xevo G2 Q-TOF)，紫外可见分光光度计(UV-800，上海元析仪器有限公司)，中压制备体系(C-605，BUCHI)，反向色谱柱(ODS，YMC)，柱层层析硅胶和薄层层析硅胶板(山东省烟台江友硅胶开发有限公司产品)，Sephadex LH-20凝胶(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，分析纯试剂(广州市化学试剂厂)。

1.1.2 菌种

放线菌分离自海南琼东海域蜂巢珊瑚样品，经16S rRNA序列分析鉴定为StreptomycesalbidoflavusM13.1[2]。菌种保存于厦门海洋微生物菌种保藏管理中心。

1.2 菌种活化及发酵培养

将保存于-80℃甘油管的菌株接种到已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基[3]上，于28℃恒温箱中培养3—5 d；挑取单菌落接种到2216E液体培养基中，于28℃，180 r·min-1条件下培养7 d，作为发酵的种子液；取20 mL发酵种子液接种至装有380 mL液体培养基[4](含有淀粉20 g、葡萄糖10 g、酵母提取粉5 g、细菌学蛋白胨5 g、海盐30 g)的1 L锥形瓶中，共接种100瓶，于28℃、180 r·min-1条件下培养7 d，共得到40 L发酵液。

1.3 提取与分离

将发酵液离心得到上清液，用等体积的乙酸乙酯萃取上清液，萃取3次后合并萃取液，减压浓缩得到乙酸乙酯粗提物21 g。将得到的粗提物用硅胶拌样后置于柱层析硅胶中，用洗脱剂石油醚和二氯甲烷-甲醇(体积比50∶1→1∶1)依次进行洗脱，在薄层硅胶板上点样、展开、显色后，将其划为10个馏分(Fr1-Fr10)。

Fr3 (69.8 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比50∶50→100∶0)、Sephadex LH-20凝胶洗脱得到化合物1(25.8 mg)、2(46.8 mg)。Fr5(186.5 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比60∶40→100∶0)、Sephadex LH-20凝胶及薄层色谱板制备得到化合物3(1.5 mg)。Fr7(1.04 g)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比15∶85→100∶0)、Sephadex LH-20凝胶甲醇-水洗脱得到化合物4(4.1 mg)和5(5.1 mg)。Fr8(419.2 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比50∶50→100∶0)、Sephadex LH-20凝胶洗脱得到化合物6(66.2 mg)、7(3.5 mg)、8(57.8 mg)。Fr9(317.6 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比15∶85→100∶0)、Sephadex LH-20凝胶洗脱得到化合物9(2.4 mg)、10(4.7 mg)。最后一段Fr10(611.0 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比25∶75→100∶0)、Sephadex LH-20凝胶及乙腈-水(体积比10∶90→95∶5)的HPLC液相色谱柱纯化得到化合物11(13.6 mg)、12(2.0 mg)、13(2.6 mg)。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物1：白色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z: 247.133 9 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.71 (1H,dd,J=5.7,1.1 Hz,H-3),6.11(1H,dd,J=5.7,1.9 Hz,H-2),5.13(1H,m,H-4),2.57(1H,m,H-10),2.14 (3H,s,H-12),1.80(1H,m,H-5a),1.60—1.69(2H,m,H-9a,H-5b),1.34—1.46(7H,m),1.06(3H,d,J=7.0 Hz,H-13);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC216.5(C-11),176.4(C-1),160.2(C-3),122.1(C-2),86.1(C-4),48.6(C-10),34.5(C-5),34.3(C-9),30.9(C-7),28.7(C-12),28.5(C-8),26.4(C-6),17.1(C-13)。上述数据与文献[5]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one。

化合物2：白色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z: 319.081 6 [2M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,400 MHz),δH7.60—7.38 (5H,m),7.67 (1H,d,J=16.0 Hz,H-8),6.47 (1H,d,J=16.0 Hz,H-7);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC170.9 (COOH),146.9 (C-1),136.3 (C-4),131.9 (C-8),130.5 (C-3,C-5),129.7 (C-2,C-6),119.4 (C-7)。上述数据与文献[6]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为肉桂酸。

化合物3：黄色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z:211.1143 [M+H]+。1H-NMR (CD3OD,400 MHz),δH4.25 (1H,t,J=6.92 Hz,H-9),4.12 (1H,m,H-6),3.51—3.48 (2H,m,H-3),2.32—2.26 (2H,m,H-5),2.06—1.83 (4H,m),1.48—1.53 (1H,m),0.95 (3H,d,J=2.68 Hz,H-12),0.94 (3H,d,J=2.44 Hz,H-13);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC173.3(C-1),169.4(C-7),60.8(C-6),55.1(C-9),46.9 (C-3),39.9 (C-10),29.6 (C-5),26.2 (C-11),24.1 (C-4),23.8 (C-12),22.7 (C-13)。上述数据与文献[7]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为环(亮-脯)二肽。

化合物4：白色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z:265.144 6 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.71(1H,d,J=5.7Hz,H-4),6.11(1H,dd,J=5.7,1.5 Hz,H-3),5.14(1H,m,H-5),3.56(1H,d,J=6.4 Hz,H-7′),1.82—1.64(2H,m,H-1′),1.49—1.36(8H,m,H-2′,3′,4′,5′),1.11(3H,d,J=6.4 Hz,H-8′),1.07(3H,s,6′-Me);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC176.4(C-2),160.2(C-4),122.0(C-3),86.1(C-5),76.2(C-6′),74.6(C-7′),39.5(C-5′),34.5 (C-1′),31.6(C-4′),26.5(C-2′),24.7(C-3′),22.1(C6′-Me),18.1 (C-8′)。上述数据与文献[8]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为5-(6,7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H)-one。

化合物5：白色粉末，1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.20(2H,m,H-3,6),3.51(2H,m,H-9),2.50—2.00(4H,m,H-7,H-8),1.37(3H,d,J=6.92 Hz,H-10);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC173.1(C-2),169.6(C-5),61.0(C-6),52.6(C-3),46.9(C-9),29.7(C-7),24.1(C-8),16.2(C-10)。上述数据与文献[9]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为环(丙-脯)二肽。

化合物6：白色粉末，1H-NMR (CD3OD,400 MHz),δH7.58(1H,d,J=15.92 Hz,H-7),7.43(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.81(2H,d,J=8.35 Hz,H-3,5),6.26(1H,d,J=15.88 Hz,H-8);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC171.2(C-9),161.1(C-4),146.5(C-7),131.1(C-2,6),127.2(C-1),115.8(C-3,5),115.8(C-8)。上述数据与文献[10]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为香豆酸。

化合物7：白色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z: 207.110 7 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.0(1H,d,J=0.72 Hz,H-3),3.93(1H,dd,J=8.4,4.72 Hz,H-6),1.75(2H,m,H-7),1.63(1H,m,H-8),1.44(3H,d,J=7.08 Hz,H-11),0.96(6H,t,J=6.84 Hz,H-9,10);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC172.0(C-2),171.5(C-5),55.1(C-6),52.4(C-3),45.6(C-7),25.8(C-8),24.0(C-10),22.6(C-9),21.4(C-11)。上述数据与文献[11]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为环(丙-亮)二肽。

化合物8：白色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z:202.084 8 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.04(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.73(2H,d,J=8.44 Hz,H-3′,5′),3.34(2H,t,J=7.24 Hz,H-1),2.69(2H,t,J=7.6 Hz,H-2),1.91(3H,s,H-Me);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC173.7(C=O),157.3(C-4′),131.7(C-1′),131.2(C-2′,6′),116.7 (C-3′,5′),42.9(C-1),36.1(C-2),23.0(Me)。上述数据与文献[12]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为N-乙酰基酪胺。

化合物9：白色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z: 283.107 1 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.30—7.20(5H,m,H-Ar),4.48(1H,t,J=4.96 Hz,H-4),4.35(1H,dd,J=11.6,4.1 Hz,H-6),4.27(1H,t,J=4.72 Hz,H-9),3.70(2H,dd,J=13.0,5.08 Hz,H-3),3.27—3.13(2H,m,H-5),2.05(2H,dd,J=13.5,5.92 Hz,H-10);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC171.8(C-1),167.6(C-7),137.9(C-1′),131.5(C-2′,6′),130.0(C-3′,5′),128.6(C-4′),69.0(C-4),58.8(C-6),58.1(C-9),55.7 (C-3),39.4(C-5),38.5(C-10)。上述数据与文献[13]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为环(4-羟基-脯-苯丙)二肽。

化合物10：白色粉末，1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.00(1H,q,J=7 Hz,H-2),3.91(2H,brs,H-2′),1.43(3H,d,J=7.04 Hz,H-3);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC172.1(C-1),169.3(C-1′),52.2(C-2),45.9(C-2′),19.9(C-3)。上述数据与文献[14]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为环(甘-丙)二肽。

化合物11：白色粉末，1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.22(1H,m,H-2),4.09(1H,d,J=16.8 Hz,H-2′),3.73(1H,d,J=16.8 Hz,H-2′),3.55—3.50(2H,m,H-5),2.30—1.85(4H,m,H-3,4);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC172.5(C-1),166.9(C-1′),60.3(C-2),47.5(C-2′),46.8(C-5),29.9(C-3),23.8(C-4)。上述数据与文献[15]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为环(甘-脯)二肽。

化合物12：白色晶体，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z：267.1 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH8.00(1H,d,J=8.08 Hz,H-6),5.88(1H,d,J=4.56 Hz,H-1′),5.69 (1H,d,J=8.08 Hz,H-5),4.15(2H,m,H-2′,3′),3.99(1H,m,H-4′),3.38(2H,dd,J=12.28,2.72 Hz,H-5′);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC166.8(C-4),153.0(C-2),143.2(C-6),103.2(C-5),91.2(C-1′),86.8(C-4′),76.2(C-3′),71.8(C-2′),62.8(C-5′)。上述数据与文献[16]报道的数据基本一致，故鉴定化合物为尿嘧啶核苷。

化合物13：白色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MSm/z:281.075 3 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH8.08(1H,d,J=8.12 Hz,H-6),5.94(1H,d,J=3.6 Hz,H-1′),5.68(1H,d,J=8.08 Hz,H-5),4.23(1H,t,J=5.6 Hz,H-3′),3.96(1H,m,H-4′),3.84(2H,m,H-5′),3.75 (1H,dd,J=12.36,2.92 Hz,H-2′),3.51(3H,s,-OCH3);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC166.7(C-4),152.7(C-2),143(C-6),103.0(C-5),89.3(C-1′),86.6(C-4′),85.5(C-2′),70.3(C-3′),62.1(C-5′),59.3(C2′-OMe)。上述数据与文献[17]与文献报道的数据基本一致，故鉴定化合物为2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷。

化合物1—13的化学结构如图1所示。

图1 化合物1—13结构

2.2 化合物活性测定结果

采用 CCK-8法，测定13个化合物对人宫颈癌细胞(HELA)、食管癌细胞(ECA-109)、肝癌细胞(BEL-7402)、膀胱癌细胞(BIU-87)、胰腺癌细(PANC-1)的抗细胞增殖活性。结果显示，13个化合物均无明显的抗肿瘤细胞增殖活性。

3 结论

从放线菌S.albidoflavusM13.1次级代谢产物中，分离获得13个化合物。经鉴定，其中有6个二肽类化合物，分别为环(亮-脯)二肽(3)、环(丙-脯)二肽(5)、环(丙-亮)二肽(7)、环(4-羟基-脯-苯丙)二肽(9)、环(甘-丙)二肽(10)、环(甘-脯)二肽(11)；有2个呋喃类化合物，分别为5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one(1)、5-(6,7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H) -one(4)；有2个核苷类化合物，分别为尿嘧啶核苷(12)、2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(13)；此外还有1个肉桂酸(2)、1个香豆酸(6)、1个N-乙酰基酪胺(8)。以上13个化合物均为首次从珊瑚来源的S.albidoflavusM13.1 样品中分离得到。对13个化合物进行了体外抗肿瘤细胞增殖活性检测，均未发现明显的活性化学成分。