彩色马蹄莲品种对果胶软腐杆菌Pcc抗性的评价方法及鉴定

张琪 郭彦兵 李紫薇 吴红芝

摘  要：為探索彩色马蹄莲（Zantedeschia spp.）接种胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovora subsp. Carotovora， Pcc）的适宜方法，鉴定彩色马蹄莲组内品种对软腐病菌Pcc的抗性情况，本研究先以10个彩色马蹄莲品种为试验材料，进行以完整叶片、叶片圆片（叶盘）为接种材料的室内离体接种，以及以主脉、侧脉为接种部位的温室活体植株接种，接种后分别于12、24、36 h 3三个时间点，以发病率、病情指数为指标，统计马蹄莲软腐病发病情况;在明确适宜的接种方法和发病时间后，选取包括第1一步试验品种在内的34个彩色马蹄莲品种进行Pcc抗性鉴定。结果表明：离体接种的最佳材料为完整叶片，最佳发病观察时间是24 h;活体接种的最佳接种部位为叶片主脉，最佳发病观察时间是36 h;离体鉴定的中抗品种为5个，感病品种为11个，高感品种为18个;而活体鉴定的中抗、感病和高感品种分别为2、17、15个。离体方法鉴定结果的中抗品种多于活体鉴定的，离体方法鉴定的抗性情况更接近更符合田间大规模生产的情况，其原因可能是离体方法鉴定时接种材料的均一性、环境条件的一致性好，方面更容易控制，更能反应品种本身的抗性情况。

关键词：彩色马蹄莲;细菌性软腐病;离体抗性鉴定;活体抗性鉴定

中图分类号：S436.8      文献标识码：A

Abstract： The study was aimed to explore the suitable inoculation method of soft rot pathogen Pcc on the colored Zan-tedeschia spp.， and identify the resistance of the varieties in the section Aestivae， which are called the colored Zantede-schia spp. to Pcc. Ten cultivars from the section Aestivae were used as the experimental materials to explore the suitable method for Pcc inoculation. Whole leaf and disk disc were used as the inoculation material in the identification in vitro， and main vein or lateral vein of the plants were compared for suitable inoculation site in the field identification in vivo. Disease incidence and disease index was observed at 12 h， 24 h and 36 h respectively after inoculation. After the suitable inoculation method and the best time of observing disease development were confirmed， 34 cultivars of colored Zantedeschia spp.， including the 10 cultivars used in the first experiment were selected to identify the resistance to Pcc. The suitable material for inoculation in vitro was whole leaf， and the best observation time was 24 hours，  main vein was better inoculation site than lateral vein for the plant in field， and the best observation time was 36 hours. There were 5 moderately resistant varieties， 11 susceptible varieties， and 18 highly susceptible varieties in the identification in vitro. There were 2 moderately resistant varieties， 17 susceptible varieties， and 15 highly susceptible varieties in the field identification in vivo. There were more moderately resistant varieties in the identification in vitro than that ones in vivo， which was in line with the situation of large-scale production in the field. The reason maybe it is easier to control the uniformity of materials inoculated and the consistency of environmental conditions in the identification in vitro than that in the field plant， so it is better to test the resistance of Zantedeschia spp. varieties to Pcc.

Keywords： Zantedeschia spp.; bacterial soft rot; in vitro resistance identification; in vivo resistance identification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.025

彩色马蹄莲（Zantedeschia spp.）是天南星科（Araceae）马蹄莲属（Zantedeschia）多年生草本球根花卉，其花型独特，花叶俱赏，具有极高的观赏价值，深受国内外消费者的喜爱[1-2]。由胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovora subsp. Carotovora， Pcc）引起的软腐病被称作彩色马蹄莲“癌症”[3-5]，是威胁彩色马蹄莲产业健康发展的重要病害。Pcc可以侵染马蹄莲各个生长阶段植株的任何部位，初期侵染部位病斑呈水渍状，且病健交界明显，随着侵染面积不断扩大，染病组织开始软化和腐烂，并散发出恶臭，最终导致植株死亡[6]。尚无有效的防治方法，目前主要采用严格的综合措施防治马蹄莲软腐病[7-8]，因此选育抗病品种是控制该病害的有效途径。

植株抗性的表型鉴定是抗病育种工作的重要环节，鉴定方法主要有离体接种和活体接种2种，离体接种是以生长发育和大小基本一致的植物组织（叶片、叶柄等）为材料[9-10]，接种Pcc后置于环境可控的培养箱中观察发病情况，并进行病害等级评价;活体接种是以完整植株的植物组织为材料，将Pcc接种于植株的适宜部位后，进行病情统计和抗病等级评价[11-12]。目前，关于彩色马蹄莲离体接种和活体接种的适宜方法尚无报道。

本研究以10个彩色马蹄莲品种为材料，对彩色马蹄莲离体接种和活体接种的接种材料、接种部位、发病时间进行比较研究，获得彩色马蹄莲Pcc抗性鉴定的适宜方法后，对34个彩色马蹄莲品种的软腐病抗性进行鉴定，以期为彩色马蹄莲生产及马蹄莲软腐病抗病育种研究提供抗性资源和技术支持。

1  材料与方法

1.1  材料

以目前市场流行的34个彩色马蹄莲品种：‘Ym109’‘Ym110’‘Ym105’‘Ym031’‘Ym064’‘Ym035’‘Ym004’‘Ym067’‘Ym023’‘Ym015’‘Ym088’‘Ym107’‘Ym038’‘Ym066’‘Ym043’‘Ym007’‘Ym063’‘Ym034’‘Ym044’‘Ym022’‘Ym017’‘Ym025’‘Ym032’‘Ym024’‘Ym166’‘1712’‘1708’‘1716’‘1734’‘1735’‘1713’‘1714’‘1715’‘1722’为抗性鉴定试验材料，其基本信息如表1，其中‘1708’‘1713’‘1716’‘1722’‘1734’‘1735’‘Ym031’‘Ym034’‘Ym015’‘Ym109’10个品种同时用于发病时间、接种材料、接种部位的比较试验。

利用彩色马蹄莲带芽块茎进行外植体培养，通过增殖、壮苗和生根获得大量长势一致、生长健壮的组培苗，炼苗一周后，移栽到装有无菌基质的营养钵中，并放在温室中进行同质化水肥管理，待马蹄莲幼苗叶片长出3～5片时，即可接种Pcc进行后续鉴定试验。

1.2  方法

1.2.1  软腐病菌Pcc的培养方法  将保存于‒80 ℃冰箱的Pcc菌株取出，采用平板稀释涂布法在固体牛肉膏蛋白胨（NA）培养基上活化。用无菌牙签挑取单菌落置于装有液体NA培养基的50 mL無菌离心管中，28 ℃摇床上250 r/min震荡培养24 h后，利用血球计数板法计算菌液浓度[13]，用无菌水将菌液浓度稀释为108 CFU/mL备用。

1.2.2  马蹄莲离体接种Pcc  待马蹄莲移栽苗长至3～5片叶后，从田间采集长势一致、大小均一的健康叶片，留1～2 cm叶柄，保湿后带回实验室，用无菌水将叶片表面冲洗干净，用于完整叶片和叶片圆片（叶盘）的Pcc接种。完整叶片的接种方法为：将完整叶片的叶柄用吸有无菌水的无菌脱脂棉保湿，每个品种接种3片叶，3次重复，接种后分别放在垫有无菌吸水滤纸的方形盘中。叶盘法的接种方法为：用灭菌的直径10 mm的打孔器将叶片打孔获得叶盘，将叶盘放在垫有无菌吸水滤纸的培养皿中，每个品种接种3个皿，每皿接种11个叶盘。2种材料均采用注射法接种，无菌注射器吸取10 µL的Pcc菌液注射入叶片/叶盘正面主脉，以同样的接种方法接种等量（10 µL）的无菌水作对照，接种后置于28 ℃恒温培养箱中，期间喷无菌水保湿，分别于接种后12、24、36 h时计算病情指数。

1.2.3  马蹄莲活体接种Pcc  将马蹄莲组培苗移栽至温室中培养，待其长至3～5片叶时，选择天气晴朗、温室温度约22～28 ℃的上午进行接种。每个品种选择长势一致的植株，每株接种3片叶，共接种30株苗，其中主脉和侧脉各接种15株，注射法接种10 µL菌液，以同样的接种方法接种等量（10 µL）无菌水作对照。分别于接种12、24、36 h时计算病情指数。

1.2.4  不同品种彩色马蹄莲的抗性鉴定  按照上述步骤筛选出的适宜鉴定方法对34个供试彩色马蹄莲品种进行Pcc抗性鉴定。在Pcc接种后12、24、36 h 3个时间段，计算病情指数和抗性分级。首先使用画有刻度线的黑色纸板作为背景，对各品种的感病叶片拍照，再将照片导入图像处理软件ImageJ V1.8.0中进行病斑面积和完整叶片面积的计算，根据病情分级标准（表2）进行病害级别划分，计算病情指数后，按照抗病性归类标准（表3）对各品种进行抗性评价。

计算公式为：

（1）发病率=发病株数/接种总株数×100%

（2）病情指数=[∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值）]×100。

1.3  数据处理

试验数据采用Microsoft Excel软件录入整理，采用DPS V9.01软件进行方差分析。

2  结果与分析

2.1  彩色马蹄莲Pcc接种适宜离体材料及鉴定时间的筛选

由表4可知，离体完整叶片接种24 h和叶盘接种12 h时，彩色马蹄莲品种间软腐病抗病性存在显著差异（P<0.05）。10个供试马蹄莲品种分别采用完整叶片和叶盘法接种后的抗性评价为：‘1735’‘Ym109’‘Ym031’表现为中抗（MR）;‘1708’‘1716’、‘1722’‘Ym015’‘Ym034’表现为感病（S）;‘1713’‘1734’表现为高感（HS）。结果表明，完整叶片和叶盘2种接种材料中，10个品种的抗性评价一致，说明完整叶片和叶盘这2种材料均适用于彩色马蹄莲Pcc离体抗性鉴定。结合图1和图2可知，叶盘接种鉴定法比完整叶片接种鉴定法发病速度快，叶盘接种24 h时大部分品种的病斑面积接近100%，已无法区分品种的抗性差异。可见完整叶片更适合作为离体接种的材料。

由表5可知，离体完整叶片和叶盘接种Pcc后的发病率随接种时间的延长而不断增大（12 h<24 h<36 h），且马蹄莲品种间存在显著差异（P<0.05）。在24 h时，发病达到高峰，而36 h时的发病率较24 h时变化不大，发病情况基本稳定。从图1可看出，完整叶片接种24 h时，病斑面积较为明显，而接种36 h时，整片叶均被病菌侵染，无法准确计算病斑面积;由图2可知，叶盘接种12 h时病斑面积较大，而接种24 h时病斑几乎浸渍整个叶盘无法准确计算病斑面积。可见，根据马蹄莲离体叶片接种Pcc后病斑面积的变化趋势，离体接种适宜的发病时间为24 h。

2.2  彩色马蹄莲Pcc活体接种适宜部位及鉴定时间的筛选

由表6可知，植株叶片主脉和侧脉接种Pcc 36 h时，‘Ym109’接种主脉鉴定为中抗品种（病情指数为46.20），接种侧脉鉴定为感病品种（病情指数为68.70），而其他品种抗性评价基本一致，部分品种的病情指数达到差异显著水平（P< 0.05）。‘Ym109’接种过程中由于分布侧脉的叶片较薄，注射菌液时容易把叶片刺穿，造成伤口，加快发病速度，因此彩色马蹄莲活体接种Pcc适宜的接種部位为叶片主脉（图3）。

从表7可以看出，不同彩色马蹄莲品种叶片主脉和侧脉接种Pcc后，马蹄莲品种间各时间点的发病率均存在显著差异（P<0.05），且发病率均在36 h时达到最大。其中，主脉接种12、24、36 h时的最高发病率分别为86.67%、93.47%、100.00%;侧脉接种12、24、36 h时的最高发病率分别为80.00%、85.00%、93.60%。由图4可看出，马蹄莲叶片主脉在接种Pcc后于不同的时间点（12、24、36 h）进行发病情况观察发现，病斑面积随接种时间的延长而不断扩大，36 h时各个品种的叶片病斑最为明显，此时能较为准确地鉴定马蹄莲抗性。因此，马蹄莲活体接种最佳发病时间为接种后36 h。

2.3  彩色马蹄莲组内不同品种的抗性鉴定

2.3.1  离体抗性鉴定  离体完整叶片接种Pcc 24 h对34个供试品种进行Pcc抗性鉴定。由表8可知，不同抗性等级的部分品种间病情指数达到差异显著水平（P<0.05），供试品种的发病率在81.33%～100.00%之间，病情指数在53.99～93.86之间，其中，表现为中抗（MR）、感病（S）和高感（HS）的占比分别为14.71%、32.35%和52.94%。中抗（MR）的品种有：‘1735’‘Ym109’ ‘Ym110’‘Ym105’‘Ym031’，其病情指数分别为57.51、59.59、53.99、57.69、54.20。

2.3.2  活体抗性鉴定  马蹄莲苗期叶片主脉接种Pcc 36h进行抗性鉴定表明（表9），不同抗性等级的部分供试品种间病情指数达到差异显著水平（P<0.05），各品种发病率在62.39%～97.94%之间，病情指数在50.77～93.76之间。对34个供试品种进行抗性评价发现，中抗（MR）、感病（S）和高感（HS）品种分别占5.90%、50.00%和44.10%，其中品种‘Ym031’和‘Ym110’的抗性评价为中抗（MR），其病情指数分别为50.77和52.76。

3  讨论

植物病原抗性鉴定时，接种植物材料的不同会影响接种病菌后的病情发生情况，马蹄莲Pcc抗性鉴定常用的接种材料有叶片[11]、叶柄[3-4]、茎[12]、种球[14]等组织。本研究以彩色马蹄莲苗期完整叶片和叶盘为材料，通过注射法接种Pcc，结果表明，完整叶片接种24 h时病斑症状明显且能区分不同品种间的差异，36 h时所有品种病斑几乎扩展整个叶片;相比完整叶片接种，叶盘法接种24 h时病斑几乎扩展至整个叶盘，病害症状发展过快，难于区分不同品种间的抗性差异。因此，彩色马蹄莲苗期离体接种时，适宜的接种材料为完整叶片。

不同的接种方法对植株的发病情况也有影响，细菌接种常用的方法有针刺法、涂抹法、喷雾法、注射法。王雪皎等[11]以彩色马蹄莲叶片为材料，采用叶片喷菌液、针刺侵染菌液、注射器注射菌液3种方法接种Pcc，发现只有针刺法和注射法能使叶片发病。商雨等[15]采用直接叶片喷菌液、伤口喷菌液、针刺侵染菌液3种方法接种Pcc至彩色马蹄莲叶片，发现只有伤口喷菌液和针刺接种菌液能使叶片产生发病。说明Pcc病菌入侵植株需要有伤口。针刺法造成的伤口不均一且菌液量难以控制，相比针刺法，注射法伤口少且能实现定量注射菌液，使鉴定结果更为准确，可作为抗性鉴定和评价的依据。

光温水汽等外在环境条件以及品种之间基因型的差异也是影响植物发病的重要因素[16-17]。本研究发现34个彩色马蹄莲品种的离体和活体抗性鉴定结果存在差异。离体鉴定的抗性情况更接近田间大规模生产，这可能是由于离体接种是在室内，温湿度等环境条件一致性好，环境差异导致的影响小，更能反应品种本身的抗性情况。此外，在离体接种中，较容易获得长势一致，大小均一的叶片较容易，而在活体抗性鉴定中，不易获得长势一致，大小均一的植株不容易。

本研究鉴定了国内普遍栽培的34个彩色马蹄莲品种的软腐病抗性，是国内主要栽培彩色马蹄莲品种对软腐病菌Pcc抗性的首次报道，为彩色马蹄莲软腐病防控和研究应用提供了有力支持。从数量和栽培品种的覆盖率方面，本研究远远超过王雪皎等[11]报道的6个品种，其中‘Ym044’和‘Ym063’在本研究中也为供试品种。在王雪皎等[11]的鉴定中，这2个品种的抗性等级均为中抗，与本研究中‘Ym044’高感、‘Ym063’感病的结果不一致。本研究和王雪皎等[11]的研究中使用的方法均为注射法接种活体植株，而鉴定结果产生差异的原因可能是由于活体鉴定的植株长势和环境条件存在差异。

4  结论

本研究以10个彩色马蹄莲品种为材料，通过离体接种（完整叶片、叶盘）和温室活体接种（主脉、侧脉）以及接种后12、24、36 h 3三个时间段内马蹄莲软腐病发病情况的统计分析，发现离体接种的最佳材料为完整叶片，最佳病情统计时间是24 h;温室活体接种的最佳部位是叶片主脉，最佳病情统计时间是36 h。

采用完整叶片离体接种鉴定法和温室活体主脉接种鉴定法对34个彩色马蹄莲品种进行Pcc抗性鉴定，离体鉴定结果为中抗品种5个，感病品种11个，高感品种18个;温室活体鉴定结果为中抗品种2个，感病品种17个，高感品种15个，2种方法鉴定的结果稍有差异。

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责任编辑：谢龙莲