妊娠期高血压疾病孕妇肠道sIgA包裹菌群构成分析

于晋然 缪婷婷 孙卓杰 张丽霞 李静 孙永叶

[摘要] 目的 探討肠道分泌型免疫球蛋白A（sIgA）包裹菌群构成与妊娠期高血压疾病（妊高症）发生的关联。

方法 选取计划在常州市妇幼保健院分娩的20例妊高症孕妇作为病例组，按照年龄、孕周匹配同期健康孕妇40例作为对照组。采用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总蛋白、清蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、尿酸、C-反应蛋白等水平。免疫磁珠法富集分离粪便sIgA包裹菌，行16S rDNA扩增子测序。

结果 病例组孕妇孕前体质量、初产妇比例、血清总胆固醇、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐和尿酸等均显著高于对照组（t=2.22～9.07，χ2=4.27，Z=2.12，P<0.05），而总蛋白和清蛋白水平显著低于对照组（t=2.54、3.28，P<0.05）。两组间sIgA包裹菌群β-多样性比较差异有显著性（F=9.39，P<0.01），且病例组α-多样性香浓指数和辛普森指数显著高于对照组（Z=3.31、3.26，P<0.01）。病例组Streptococcaceae科、Enterobacteriacea科、Lactococcus属和Streptococcus属相对丰度明显高于对照组（Z=2.01～3.98，P<0.05），而Enterococcaceae科和Lactobacillus属相对丰度显著低于对照组（Z=3.50、3.50，P<0.05）。孕妇收缩压和舒张压与Lactobacillus属相对丰度呈显著负相关（ρ=-0.41、-0.43，P<0.05），与Lactococcus属和Streptococcus属相对丰度呈显著正相关（ρ=0.31～0.50，P<0.05）。

结论 妊高症病人肠道sIgA包裹菌群构成发生了显著变化，肠道sIgA包裹的Lactobacillus属相对丰度降低，Streptococcaceae科、Streptococcus属、Enterobacteriacea科和Lactococcus属相对丰度升高，可能与妊高症的发生发展有关。

[关键词] 高血压，妊娠性;胃肠道微生物组;免疫球蛋白A，分泌

[中图分类号] R714.246;R378.2

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0874-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.148

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210706.1547.006.html;2021-07-07 09：06：24

COMPOSITION OF SECRETED IMMUNOGLOBULIN A-COATED INTESTINAL FLORA IN PREGNANT WOMEN WITH HYPERTENSIVE DISORDERS OF PREGNANCY

YU Jinran， MIAO Tingting， SUN Zhuojie， ZHANG Lixia， LI Jing， SUN Yongye

（School of Public Health， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the association of the composition of secreted immunoglobulin A （sIgA）-coated intestinal flora with the development of hypertensive disorders of pregnancy.

Methods A total of 20 pregnant women with hypertensive disorders of pregnancy who planned to give birth in Changzhou Maternal and Child Health Hospital were enrolled as case group， and 40 healthy pregnant women， matched for age and gestational weeks， were enrolled as control group. An automatic biochemical analyzer was used to measure the serum levels of total cholesterol， triglyceride， high-density lipoprotein cholesterol， low-density lipoprotein cholesterol， total protein， albumin， alanine transaminase， aspartate aminotransferase， glutamyl transpeptidase， urea， creatinine， uric acid， and C-reactive protein. Fecal sIgA-coated flora were enriched by magnetic activated cell sorting， and 16S rDNA amplicon sequencing was performed.

Results Compared with the control group， the case group had significantly higher pre-pregnancy body weight， proportion of primiparas， and serum levels of total cholesterol， glutamyl transpeptidase， urea， creatinine， and uric acid （t=2.22-9.07，χ2=4.27，Z=2.12，P<0.05）， as well as significantly lower serum levels of total protein and albumin （t=2.54，3.28;P<0.05）. There was a significant difference in the β-diversity of sIgA-coated flora between the two groups （F=9.39，P<0.01）， and the case group had significantly higher α-diversity Shannon index and Simpson index than the control group （Z=3.31，3.26;P<0.01）. Compared with the control group， the case group had significantly higher relative abundances of Streptococcaceae， Enterobacteriaceae， Lactococcus， and Streptococcus （Z=2.01-3.98，P<0.05） and significantly lower relative abundances of Enterococcaceae and Lactobacillus （Z=3.50，3.50;P<0.05）. Systolic pressure and diastolic pressure of pregnant women were negatively correlated with the relative abundance of Lactobacillus （ρ=-0.41，-0.43;P<0.05） and were positively correlated with the relative abundances of Lactococcus and Streptococcus （ρ=0.31-0.50，P<0.05）.

Conclusion There is a significant change in the composition of sIgA-coated intestinal flora in patientswith hypertensive disorders of pregnancy， with a reduction in the relative abundance of intestinal sIgA-coated Lactobacillus and increases in the relative abundances of Streptococcaceae， Streptococcus， Enterobacteriaceae， and Lactococcus， which may be associated with the development and progression of hypertensive disorders of pregnancy.

[KEY WORDS]hypertension， pregnancy-induced; gastrointestinal microbiome; immunoglobulin A， secretory

妊娠期高血压疾病（妊高症）是妊娠与高血压并存的一组疾病，能够使高达10%的妊娠复杂化[1]，出现胎盘早剥、早产、胎儿生长受限甚至死亡等不良结局。该组疾病可分为妊娠期高血压、子痫前期和慢性高血压并发子痫前期等亚型。据调查，全球妊娠期高血压和子痫前期的患病率分别为1.8%～4.4%和0.2%～9.2%[2]。队列研究发现，曾患妊高症的女性在未来患高血压等心血管疾病的风险增高[3-4]。因此，妊高症的防治是一项重要的公共卫生问题。目前，关于妊高症的发病机制主要包括遗传、自身免疫、氧化应激、内皮细胞功能紊乱和炎症反应等[5-8]。人体庞大而复杂的肠道菌群在免疫、代谢和营养吸收等过程中起着关键作用。有研究表明，孕妇肠道菌群与血压关系密切[9-10]，臭杆菌属（Odoribacter）产生的丁酸盐可能通过抑制纤溶酶原激活物抑制剂-1的产生来控制宿主血压[9]。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是由肠黏膜组织分泌的抗体，sIgA与其包裹的25%～75%肠道菌群共同富集于结肠黏膜外层，该抗体与结肠黏膜上皮表面的结合能力对于其排除致病菌和与共生菌体保持互惠关系至关重要[11]。目前，有关sIgA包裹菌群与妊高症的研究甚少。本研究旨在比较常州地区妊高症孕妇与健康孕妇肠道sIgA包裹菌群构成的差异，为预防和干预妊高症提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年10—12月计划在常州市妇幼保健院分娩的妊高症孕妇20例作为病例组。病例组纳入标准：孕前血压正常，妊娠20周后出现血压升高（收缩压≥18.67 kPa和（或）舒张压≥12.00 kPa），伴或不伴有蛋白尿（24 h尿蛋白≥0.3 g）[2]。同期选择与病例组孕妇年龄、孕周相匹配的正常孕妇40例作为对照组。排除标准：孕期有吸烟、饮酒等不良嗜好;近1个月内使用过抗生素;患有心脏疾病、炎症性肠病、慢性高血压、其他妊娠并发症等疾病的孕妇。收集研究对象的基本信息，持续追踪孕妇到产前，期间如果出现符合排除标准的疾病则将该孕妇从本研究中剔除。本项研究取得常州市妇幼保健院伦理委员会的批准，并且所有纳入的研究对象均签署了知情同意书。

1.2 标本采集与检测

采集孕妇空腹静脉血5 mL，分离血清分装后冻存于-80 ℃冰箱中备用。采用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总蛋白、清蛋白、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷氨酰转肽酶（GGT）、尿素、肌酐、尿酸、C-反应蛋白（CRP）等水平。采集孕妇至少0.5 g新鲜粪便，置于-80 ℃冰箱中备用。所有研究对象的粪便标本收集完成后，采用免疫磁珠法富集分离sIgA包裹菌群[12]，使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，然后送至武汉华大医学检验所有限公司，以基于Illumina MiSeq 2500平台进行16S rDNA V4区高通量测序。然后，使用FLASH 1.2软件去除低质量的序列，拼接双末端reads以获得tags，最后通过UPARSE 7.0软件将tags按照97%的相似性聚类生成OTUs（Operational Taxonomic Units）。与Greengene数据库（201305版本）比对后应用RDP Classifier 2.2软件进行物种分类，最小置信度阈值为0.6。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料先进行正态性检验，符合正态分布计量资料以±s形式表示，数据间比较采用Student’s t檢验;非正态分布计量资料以M（P25，P75）形式表示，数据间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以数量（百分比）表示，数据间比较采用χ2检验。通过在线分析工具MicrobiomeAnalyst进行数据分析，基于Bray-Curtis距离、采用置换多因素方差分析（Permutational MANOVA）估算菌群β-多样性，可视化应用主坐标分析（PCoA）;采用Mann-Whitney U检验估算菌群α-多样性（香浓指数、辛普森指数和chao1指数）和相对丰度，采用GraphPad Prism 8.0软件绘制箱线图和百分条图。差异菌属与舒张压和收缩压的关系用Spearman相关性分析，用HemI 1.0软件绘制相关性热图。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇一般资料比较

病例组和对照组孕妇年龄、孕周、孕前BMI、孕期体质量增长和孕次相比较差异均无显著性（P>0.05）。与对照组相比较，病例组的孕前体质量、收缩压和舒张压以及初产妇比例均明显增高（t=2.56～9.07，χ2=4.27，P<0.05）。见表1。

2.2 两组孕妇血生化指标比较

两组孕妇血清TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST和CRP水平相比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。病例组血清TC、GGT、尿素、肌酐和尿酸水平显著高于对照组，差异有统计学意义（t=2.22～4.20，Z=2.12，P<0.05）;而总蛋白以及清蛋白水平显著低于对照组，差异有统计学意义（t=2.54、3.28，P<0.05）。见表2。

2.3 两组孕妇肠道sIgA包裹菌群比较

从两组60例孕妇的粪便标本中分离出sIgA包裹菌群，高通量测序得到3 433 601个高质量序列，被聚类生成1 794个OTUs。PCoA结果表明，两组β-多样性有显著分离（F=9.39，P<0.01）（图1）。进一步用α-多样性评估菌群丰富性和均匀性，结果显示病例组香浓指数和辛普森指数明显高于對照组（Z=3.31、3.26，P<0.01），

而chao1指数两组间比较差异无显著性（P>0.05）（图2）。在门水平上，病例组和对照组孕妇肠道sIgA 包裹菌群最丰富的为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）;在科水平上，病例组肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、V1和链球菌科（Streptococcaceae）相对丰度与对照组相比显著增加（Z=2.01～3.98，P<0.05），而肠球菌科（Entero-coccaceae）相对丰度与对照组相比显著降低（Z=3.50，P<0.05）;在属水平上，两组间乳球菌属（Lactococcus）、链球菌属（Streptococcus）和乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度比较差异有统计学意义，其中病例组Lactobacillus相对丰度显著低于对照组（Z=3.50，P<0.05），Lactococcus和Streptococcus相对丰度显著高于对照组（Z=2.02、3.98，P<0.05）。见图3。

2.4 孕妇肠道sIgA包裹菌属与血压相关性分析

Lactobacillus相对丰度与收缩压和舒张压呈显著负相关（ρ=-0.41、-0.43，P<0.05），Lactococcus相对丰度与收缩压和舒张压呈正相关（ρ=0.31、0.34，P<0.05），Streptococcus相对丰度与收缩压和舒张压也呈正相关（ρ=0.48、0.50，P<0.05）。

3 讨论

妊高症是较为严重的妊娠期并发症，也是全球孕产妇死亡的第二大原因[13]。该疾病病因复杂，包括但不限于血管内皮损伤、免疫平衡失调和炎症反应等[5-8]。因此，探寻妊高症的特征指标对促进孕产妇和围生儿的健康有重要意义。

本研究结果显示，妊高症病人血清TC水平显著高于对照组，但数值仍在妊娠晚期孕妇正常血脂参考范围内[14]。妊高症孕妇全身小动脉痉挛会导致肝、肾等脏器内皮细胞受损、缺血及低氧、肿胀等，增加了膜通透性，进而出现血清总蛋白和清蛋白丢失[15]、肝细胞微粒体内的GGT释放入血[16]以及肾小球滤过率下降，使得血清中尿素、肌酐和尿酸含量增多[17]。本文研究结果与其一致。

本研究显示，妊高症孕妇和对照组孕妇的肠道sIgA包裹菌群β-多样性有明显分离，说明两组孕妇肠道sIgA包裹菌群整体构成显著不同。α-多样性分析结果显示，与对照组相比，病例组香浓指数和辛普森指数明显增高，说明妊高症孕妇sIgA包裹菌群丰富性和均匀性高。本研究菌群相对丰度结果显示，病例组Streptococcaceae科和Streptococcus属相对丰度均明显高于对照组，并且Streptococcus属相对丰度与孕妇血压呈负相关关系。有研究发现发酵大豆蛋白有降压作用，推测与大豆蛋白中未被吸收的肽导致Streptococcaceae水平降低有关[18]。一项对原发性高血压病人Streptococcus的研究结果与本文的研究相同[19]。有证据表明，Streptococcus具有降低胆碱水平的作用[20]，而胆碱可以乳化胆固醇，预防高血压的发生。上述研究结果提示Streptococcaceae科和Streptococcus属可能通过降低机体胆碱水平而参与妊高症的发生发展。本研究中病例组肠道致病菌Enterobacteriaceae科相对丰度明显高于对照组。以往多项基于成年高血压病人进行的研究报道均与本文的研究结果相一致[21]。此外，MUKHOPADHYA等[22]认为，Enterobacteriaceae家族是诱发肠道内低度炎症的强势候选物种，提示Enterobacteriaceae科可能通过炎症反应而参与妊高症的发生发展。本研究中，病例组Lactobacillus属相对丰度显著低于对照组，可能与Lactobacillus能够产生血管紧张素转化酶抑制剂、改善血脂和减低体质量等有关;而病例组Lactococcus属相对丰度较对照组高，并且Lactococcus属相对丰度与孕妇血压也呈正相关。有研究显示，Lactococcus属丰度与未经治疗的高血压居民的血压水平呈正相关[23]。因此，Lactococcus属相对丰度升高可能与妊高症的发生发展有关。

综上所述，妊高症病人肠道sIgA包裹菌群构成较健康孕妇发生了显著变化。孕妇肠道中sIgA包裹的Lactobacillus属相对丰度降低，而Streptococcaceae科、Streptococcus属、Enterobacteriaceae科和Lactococcus属相对丰度升高，可能与妊高症的发生发展有关。未来可能通过靶向调节肠道菌群来达到预防和控制妊高症的目的。

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（本文編辑 黄建乡）