王天亮,于志民
(1.黑龙江省科学院,哈尔滨 150001; 2.黑龙江省科学院自然与生态研究所,哈尔滨 150040)
刺五加[Eleutherococcussenticosus(Rupr.&Maxim.)Maxim.]别名刺拐棒、坎拐棒子、五加皮等,具有益气健脾、补肾安神之功效[1-2],是重要的中药材之一、东北地区典型的药用植物、北药中紧缺的宝贵中药材,味辛、性温、微苦、无毒。《神农本草经》[3]《本草纲目》[4-5]等古代药学专著对其都有相关记载。刺五加主要分布于我国东北地区及俄罗斯西伯利亚,日本和朝鲜也有分布,散生或丛生于山地阔叶混交林缘、林下及采伐地上[6]。刺五加的根、根茎、茎、叶和果实均可入药,嫩叶可食用,作为药膳。现代药理证明,刺五加在提高免疫力、防血栓、保护心脏及调节神经中枢系统等方面具有广泛的药理作用[7]。刺五加在国外应用也十分广泛[8]。近年来,随着我国中药产业的快速发展,对刺五加原材料的需求量也逐年递增,致使野生资源逐年锐减。为了缓解中药材原料短缺问题,我国在人工栽培刺五加方面进行了研究并取得了一定成绩[9-11],随着人工栽培面积的不断扩大,一些制约发展的瓶颈问题急需解决,如刺五加黑斑病。黑斑病是刺五加栽培生产中最严重的病害之一,发病会导致其产量和质量下降,影响其药用价值。为获得优质道地的刺五加原料,开展刺五加病原学探索,找出发病机制,抑制药剂筛选,这些研究十分必要。对国内外刺五加黑斑病研究方向进行分析,并对未来研究趋势进行了展望。
有研究人员[12]参照张天宇[13]方法,对刺五加叶片上的黑斑病原菌进行了分离纯化,并从形态学方面做了分析鉴定。寄主植物上,成熟的分生孢子为褐色,单生或串生,倒棍棒形,倒梨形,直立或略有屈膝,具3~8个横隔膜或半横隔膜,淡褐色,为2.0~5.1×10.4~47.7 μm。部分孢身底部逐渐延伸为长短不等的柱状假喙。分生孢子梗淡褐色至深褐色,基部细胞略膨大,单生或簇生,偶有分支,直立,少有弯曲,有隔膜,长度变化较大,宽度变化较小,为3.0~6.0×25.0~75.0 μm。病原菌在PDA培养基上,25℃培养2 d,即可长出白色丝状菌落,随着生长,菌落变为绿色。菌落边缘整齐,为灰白色菌丝,25℃光暗交替培养15 d以上后,产孢子。分生孢子颜色加深,孢子大小无变化,喙一部分缩短变粗转化为次生分生孢子。在PCA培养基上,菌落呈灰白色,气生菌丝较少,边缘整齐。在PCA+滤纸上光暗交替培养9 d后,产生分生孢子链。长链着生分生孢子梗上,偶有孢子萌发形成侧链。孢子形态与寄主植物上略微有变化,孢子大小有较大变化。根据形态学特征,初步判定该菌为链格孢属细极链格孢[Alternaria.tenuissima (Fr) Wiltshire][14]。
支叶[12]等利用序列比对分析方法,对黑斑病进行了病原菌分子生物学鉴定,结果表明,菌株A,tenuissima isolate CWZ-12的序列与GenBank中的A.tenuissima isolate XSD-83(登录号:EU326185)的遗传距离最近,位于系统发育树的同一分支。
刺五加黑斑病原菌传染性极强,在人参、蓝莓、五味子、黄瓜、茄子、紫薯、燕麦、玉米等植株发病叶片中均可分离得到刺五加黑斑病原菌,发病程度以菊科、蔷薇科植株严重,病斑症状接近病原菌侵染刺五加的症状[12]。
刺五加黑斑病发病时间集中在6~8月,低温高湿等适宜环境下易发病,主要危害叶片。其从下部叶正面开始侵染,病斑初期为黑色小斑,逐步扩大至左右的近圆形大斑,外围为黑色水渍状,后期严重时扩大为13~15 mm不规则型病斑连片,中间干枯穿孔。从其发病条件可以明确,发病诱因与环境水热条件、营养类型等密不可分。魏书琴[15-16]等通过研究发现,碳源吸收能力从低至高依次为多糖<二糖<单糖。氮源中,对真蛋白质类的吸收能力最强。5℃~35℃均可生长,20℃~30℃下生长较为迅速。在pH 2~12下,病原菌均可以生长,pH 6时最适生长。连续紫外灯照射的菌落长势最好。魏书琴等对黑斑病孢子萌发条件进行了研究发现,刺五加黑斑病菌在5℃~25℃孢子萌发率与温度呈正相关,在高于25℃条件下,病原菌孢子萌发率下降,证明该病原菌孢子萌发的最适温度为25℃,但其在60℃以下的温度条件下均可以存活[17-19]。在水滴和相对湿度为93%时,萌发率较高,湿度越低,萌发率越低,这充分证明刺五加黑斑病发病因素是多方面的,既与周围环境光热、水分等条件有关,又与寄主植物自身成分结构密切相关,这些因素变化将直接决定发病几率,为深入研究预防病原菌发病技术和方法提供了理论基础。
魏书琴[20]等研究结果表明,10%世高水分散剂、30%福嘧霉悬浮剂、50%扑海因WP和20%黑星叶霉唑超微WP对刺五加黑斑病的抑菌效果最佳。关天舒[21]等筛选出33.5%哇琳酮SC和32.5%嘧菌酯及苯醚甲环唑SC,在使用剂量很低的情况下即可达到很好的抑制效果。刘畅[22]等研究发现,不同浓度的39种药剂具有刺五加黑斑病菌室内抑菌作用。氟菌唑在室内抑菌测定和田间药效试验结果中,在试验剂量下对刺五加黑斑病均有明显的防治效果,田间效果可达67.86%~80.62%。
研究表明,高光谱成像技术的准确精度可以达到92.77%,是发病初期重要的发现和防止手段[23],但由于此类真菌绝大多数缺乏有性阶段[24],相较传统正向遗传学手段,基因突变或敲除等反向遗传学方法成为必然。研究发现,对部分目标基因进行突变或敲除,致病力并未变化,这可能与基因存在功能冗余有关[25-26],为中药材基因防病技术提供了思路和参考。
在黑斑病药剂筛选方面,由于具有环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性等特点,植物源杀菌剂逐渐成为热点之一[27-29],相关研究报道屡见不鲜[30-32]。有报道称,针对链格孢菌(Alternaria alternata),肉桂皮、百里香、丁香、柠檬草和玫瑰草等植物精油具有显著的抑菌活性[33]。国外有研究显示,采用杀真菌剂进行防治的生物功效正在减小,通过提高植物本身防御代谢调控来诱导其产生抗病性,或将成为一种创新尝试手段。