野猪非洲猪瘟监测的规范化采样管理初探

张 丽，朱向博，晁青鲜，李金邦

（太原动物园，太原030009）

据农业农村部发布的信息统计，2018年8月3日至2020年11月8日，全国共发生非洲猪瘟疫情181起。因非洲猪瘟疫情影响，大量生猪被无害化处理，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。在181起疫情中野猪疫情6起，约占国内总疫情数的3.3%，疫情分别发生于吉林白山市、黑龙江农垦总局、陕西佛坪县、湖北神农架林区等6地，加上野猪活动区域大（8～12 km2），且游走性强，染疫野猪容易散播疫病，仅有的6起疫情大大增加了非洲猪瘟防控的不确定性，增加了生猪养殖产业健康发展的风险。在有效疫苗成功研制及临床应用之前，野猪非洲猪瘟疫情监测工作势必常态化。

科学采样、规范送检是实验室非洲猪瘟检测结果准确性的必要保证。关于动物疫病监测（或检测）的采样，有国家推荐标准或者行业标准[1-5]，以及省（市）的地方标准，但每种疫病的流行病学、病理学特征及防控要点不尽相同。这些标准缺乏某种疫病样品采集的具体操作细则，参考性相对较低。

2019年至今，太原动物园野生动物疫源疫病监测站受山西省自然保护区管理站疫源疫病监测主管部门的委托，特委派专业的兽医人员进行野猪非洲猪瘟样品的采集及送检。为了确保所采集样品的科学性，保证后期非洲猪瘟实验室检测结果的准确性，结合采样实践工作，拟定以下采样细则及管理规范，以供同业参考。

1 采样前准备

1.1 采样物资准备

防护用品：生物防护服、外科医用口罩或N95口罩、护目镜、乳胶手套和胶靴等。

解剖器械：解剖刀、磨刀棒和手术刀等。

采样用品：镊子、止血钳、手术剪、生理盐水或pH 7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）、10 mL注射器、0.1 mol·L-1EDTA抗凝剂、EDTA真空采血管、2 mL离心管、采样袋、酒精棉、酒精灯、油性记号笔、无菌采样袋和铝盒等。

消毒用品：75%乙醇溶液、84消毒液和生石灰等。

临时存储运输用品：生物冰袋、生物安全运输箱或者泡沫箱及车载冷冻冰箱等。

1.2 工作准备

科学采集是有效送检的前提，科学采集的重点是要控制采集的时效性。样品采集原则上要尽可能早，死亡野猪内脏样品不应迟于死后6 h[2]。因此应提前准备好采样的物资，接报有野猪样品需要采集时，应立即携带采样物资前去。

由于林区或者野外野猪非洲猪瘟样品采集和送检的特殊性，24 h内往往完成不了，因此在采样出发前，需提前预订送检用的干冰和专用泡沫包装箱（一般需提前24 h预定干冰），或者提前联系专业冷链送检公司下样品送检订单。

1.3 传染病防控知识准备

采样的对象是被猎杀或感染未知病原死亡的野猪，是常见的野生动物源人兽共患传染病疫源。采样人员有感染猪布鲁氏杆菌病、猪链球菌病、炭疽、猪流感、森林脑炎等人兽共患传染病的风险，如果采样过程中缺乏防范此类传染病的防控知识，会严重威胁相关操作人员的生命安全及环境安全。所以，采样前相关操作人员一定要了解与野猪相关的重大疫病防感染的防护知识和防止疫病散播的防控知识。

首先，参与采样的人员，手或体表其他外露部位有外伤的不得参与解剖、采样、处理尸体或清扫消毒；其次，采样人员一定要穿防护服、胶靴，佩戴护目镜、乳胶手套、外科医用口罩或N95口罩，做好个人防护，免受传染病侵害；最后，解剖采样结束后要做好场地的消毒、解剖耗材及尸体的无害化处理，严防采样过程中把病原散播到环境中，以免造成潜在疫病的散播、流行。

2 采样过程

整个采样过程主要包括采样前对采样对象的初判、解剖取样、采样后的信息记录及无害化处理等工作。

2.1 采样前初判

不论是被猎杀而死的野猪，还是在环境中正常或非正常死亡的野猪，解剖前均要观察野猪的整体外观情况。眼观野猪尸体的眼睛、鼻腔、口腔、肛门等天然孔是否有出血，如有出血，血的颜色是否为酱油色，是否有血凝不良的现象等，对初判疑似炭疽（天然孔出血，酱油色血，血凝不良）的野猪，严禁解剖。并用无菌注射器采集疑似野猪的血液，送当地兽医实验室涂片镜检。镜检炭疽阳性的应就近进行填埋或者焚烧等无害化处理；为炭疽阴性的方可进行解剖采样。

2.2 解剖取样

2.2.1 场地处理

剖检采样要选择平坦的地方进行，且铺上厚塑料布，防止解剖过程中可能携带病原的血液、胸腹水等污染物污染解剖场地，防止疾病散播。

2.2.2 蜱虫采集

野猪非洲猪瘟本底调查需采集野猪窝或者野猪身上的蜱虫（主要为钝缘软蜱），故在剖检前要用细筛子将猪窝周边的土层过筛采集泥土中的蜱虫，或者在野猪的耳后、腋下和腹股沟等软组织区域寻找蜱虫。蜱虫在非洲猪瘟的传播中充当着重要的传播媒介，检测蜱虫的带毒情况，是野猪非洲猪瘟监测的重要一环。一般情况下，尽可能多地采集蜱虫，放至2 mL离心管中。

2.2.3 剖检体位准备

首先将野猪尸体呈仰卧位放置，然后分别从野猪两侧腋下处纵切至肩关节处下压，使两前肢向外平伸，沿腹股沟纵切至髋关节处下压，使两后肢向外平伸，以便于解剖采样。

2.2.4 血液采集

如果是活捉的野猪仔猪，可以颈静脉采血或者心脏采血。如果是被猎枪击毙的野猪，心脏可能没有未凝固的血液，在纵切前后肢过程中流出血液时，应及时使用提前用EDTA标准液湿润过的一次性无菌注射器采集血液，每份血液1～3 mL，轻摇混匀后轻轻打入EDTA真空采血管中。

2.2.5淋巴结采集

非洲猪瘟检测一般采集颌下淋巴结、腹股沟淋巴结或肠系膜淋巴结，其中腹股沟淋巴结最不易受到解剖污血、污物的污染，所以一般采集腹股沟淋巴结。腹股沟淋巴结在腹股沟皮下，常有脂肪层包裹，腹股沟左右各一个，采集时需观察淋巴结是否有水肿或者切面有无炎性症状，是否有出血等。淋巴结作为机体免疫器官，如为感染性疾病造成野猪死亡的，淋巴结或多或少会有肿大及出血的情况。

2.2.6 扁桃体采集

仔猪扁桃体可以直接用刀沿口裂切开，上下颌分开在舌根及会厌部，用灭菌的手术剪和镊子（或止血钳）采集扁桃体。亚成体及成年的野猪，采集扁桃体时，需用解剖刀先去除下巴至颈部的皮，再沿下巴下颌骨内沿切开颌下肌肉至颈部，切口呈V字形，在下巴处向外拉下巴肌肉，暴露出舌头，再把舌头拉向颈部，切开猪舌两侧的肌肉，直至暴露扁桃体。被血液或者野猪口腔中的污物所污染的扁桃体，采集后需要用生理盐水或者0.01 mol·L-1、pH 7.4的PBS液冲洗，然后放入病料袋中。

2.2.7 开腹采样

野猪扒皮后，先用手术刀切开腹部肌肉层，再用手或者钝性器械（如镊子的钝端）打开腹膜层，打开腹膜禁用尖锐器械，尖锐器械容易刺破肠道，造成肠内容物涌出污染腹腔脏器。开腹后首先采集肝脏，如果肝脏眼观有病变，则采集病变区的样品；其次采集脾脏；最后采集肾脏。非洲猪瘟阳性的猪，脾脏一般会肿大到原来的2～3倍，而阳性野猪的脾脏情况暂时未见报道。但是作为免疫器官，如果感染非洲猪瘟，野猪脾脏异常肿大的可能性非常大。

2.2.8 开胸采样

用解剖刀沿胸骨与肋骨的软骨结合处将两者分离，然后切开横膈膜即可暴露胸腔。首先观察胸腔内是否有积液或出血，其次观察心包的情况，然后再观察肺脏的外观及按压情况。最后无菌采集肺脏，并观察肺脏的切面是否有炎性渗出物及瘀血等。

注意事项：样品采集前后及过程中均需拍照记录组织脏器的解剖特征，每采集一种组织脏器，需更换手术剪、镊子等采样器械或者用乙醇擦拭灼烧，以确保各组织脏器样品不交叉污染。实质性组织器官的采样大小一般1～2 cm2（或10～15 g组织样）即可。采集胸腹腔内的脏器时，脏器有时可能被肠内容物、胸腹水、血液等污染，采集的样品应大一些，需2～3 cm2（或者20～30 g组织样），有污物的组织样需用生理盐水或者PBS液稍作冲洗后再放进采样袋中。

2.3 采样后处理

采样完成后，首先要及时填写详细的送样信息表。信息表要如实填写，跟样品一起送检。野猪送样信息表内容应包括：采样负责人及联系方式、采样日期及时间、采样地点、野猪死亡时间、野猪性别、野猪估重、野猪大概年龄、所采样品类型（肝脏、脾脏、肺脏、蜱虫等）、每种样品数量等。另外应简单备注上野猪的病理解剖描述，如脾脏有无肿大和异常，肺脏表面出血及剖面瘀血情况，肠系膜及肠道表面有无出血等。

其次，将野猪尸体及采样相关的废弃物无害化处理。野猪可以深坑填埋，填埋坑要求远离居民区、养殖区和水源，坑深要求放进野猪尸体后距离地面至少1 m深（保证尸体不被其他动物刨出来），填埋坑底层撒上2～5 cm厚的生石灰，放进野猪尸体后，身体上撒上2～5 cm厚的生石灰，再将尸体坑填土夯实，最后在夯实的坑表面撒上约1 cm厚的生石灰。也可连带解剖用的塑料垫布、防护服、乳胶手套等可燃废弃物一起焚烧处理。如有血液、腹水等污染物从塑料垫布浸透到地面的，用1 000 mg·L-1有效氯的84消毒液或2%～5%的火碱溶液对污染场地泼洒浸泡至少60 min，对野猪运输工具进行2～3遍的喷洒消毒。采样工具用酒精棉擦拭并用医用乙醇浸泡消毒至少10 min。

3 样品送检

从样品采集到送至检测机构，24 h内能完成的，全程可用添加5～6个500 mL的冷冻冰袋或冰砖的储存容量为5～10 L的生物安全运输箱或密封泡沫箱4℃冷藏送检；超过24 h的，样品需-20℃以下低温暂时冻存并运输至实验室-60℃超低温冷冻保存。送检运输途中需全程冷链冻存运输，一般采用“生物安全运输箱+干冰或者泡沫箱+干冰”包装运输。干冰的用量需根据运输时间和干冰的消耗量来计算，常规状态下，条块状干冰在4 cm厚的密封泡沫箱内或生物安全箱内每天损耗2～2.5 kg。样品应交由专业的冷链公司送货，或由专业的兽医人员送检，严防在送货途中将可能存在的病原（如非洲猪瘟病毒、猪流感病毒、猪布鲁氏杆菌等）散播到环境中。

4 小 结

在野猪非洲猪瘟本底调查采样中，采集对象可能是被猎杀的健康状况未知的野猪，或者是病死的野猪（如陕西佛坪、湖北神农架）。考虑采样过程中操作人员有感染人兽共患病的风险，要求参与采样操作的人员必须严格做好防护，从头到脚，穿戴护目镜、口罩、防护服、乳胶手套和胶靴。且采样耗材及尸体的无害化处理过程必须由兽医人员监督执行，严防操作不当造成人员感染和病原外泄散播。

每头野猪的每种样品必须至少采集3份：一份送至国家林草局野生动物疫病研究中心，一份送至省级动物疫病预防控制中心，一份留作复检备检样品（-60℃以下超低温冻存）。每个样品袋上必须标记清楚野猪的性别、大概年龄、组织脏器名称、采样时间地点及样品编号等，并详细填写加盖有采样单位公章的采样送检单。若剖检时发现内脏器官异常的，送检时最好附上图文并茂的解剖描述说明。