TCF7L2基因rs7903146位点基因多态性与2型糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病的相关性研究*

骆时木，叶宇宸，欧阳航，叶玉华，张志珊

福建医科大学附属泉州第一医院检验科，福建泉州 362000

转录因子7类似物2(TCF7L2)是一种转录因子，为高迁移率族蛋白家族的成员。研究发现TCF7L2基因多态性与2型糖尿病(T2DM)有关，在TCF7L2基因众多单核苷酸多态性位点中，rs7903146位点是目前研究较热门的位点之一，且被证实在不同的国家和人群中与T2DM易感性有紧密联系[1-2]。该位点的多态性对靶基因启动子的活性和转录概率的影响较强[3]，在Wnt信号通路中，TCF7L2自我表达的调节有重要作用[4]，但rs7903146位点与T2DM合并冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的相关性报道较少。本研究选择TCF7L2基因rs7903146位点作为研究位点，旨在分析其与T2DM合并CHD的相关性及对体内血糖和血脂水平的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年12月至2018年6月本院内分泌科就诊的T2DM患者100例为单纯T2DM组，其中男58例、女42例，平均年龄(57.73±11.76)岁。诊断标准参照我国2007年糖尿病防治指南：有糖尿病症状并伴有随机血糖≥11.1 mmol/L,或空腹血糖≥7.0 mmol/L，或既往有确切糖尿病病史，并在使用降糖药物或胰岛素者。选取同期本院心内科住院的CHD患者100例为单纯CHD组，其中男67例、女33例，平均年龄(62.09±13.33)岁。CHD的诊断标准：冠状动脉造影检查证实冠状动脉狭窄≥50%或既往有明确心肌梗死病史。选取同期心内科因CHD住院的T2DM患者100例为T2DM合并CHD组，其中男63例、女37例，平均年龄(65.28±11.22)岁。T2DM合并CHD的诊断标准同上。选取同期本院体检中心的体检健康者100例为对照组，其中男53例，女47例，平均年龄(53.35±10.96)岁，经检查排除CHD，同时无高血压、糖尿病等病史。所有研究对象主要来自福建泉州地区的汉族人群，无血缘关系。均排除肝脏疾病、肾病综合征、甲状腺或肾上腺疾病等影响血脂代谢的疾病，且近1个月内未使用降脂药物。本研究得到了本院伦理委员会的批准，所有研究对象均在试验前了解本研究的目的，并签署知情同意书。

1.2方法 (1)标本采集：所有研究对象均禁食12～14 h后，于次日清晨采肘静脉血2管。1管用乙二胺四乙酸二钾抗凝，进行糖化血红蛋白(HbA1c)检测后，标本放置-80 ℃冰箱待提取基因组DNA。另1管不抗凝，于2 h内3 000 r/min离心5 min后分离血清，用于生化指标的检测。(2)基因多态性检测：采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计TCF7L2基因rs7903146位点引物，上游为5′-AGT TTT ATT GGA GGG TTG CAC-3；下游为5′-TAG CGA AGA GAT GAA ATG TAG C-3′，引物由日本Takara公司合成。采用Qiagen试剂进行DNA的提取，BioTeke浓度检测仪检测其DNA浓度及纯度。PCR反应总体积30 μL，包括10×buffer 3 μL，dNTP 2.4 μL，正向引物和反向引物各0.6 μL，模板DNA 1.5 μL，Taq酶0.15 μL及ddH2O 21.75 μL。PCR循环条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行35次循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物使用3%的琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙啶染色，使用凝胶成像仪观察结果。扩增产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序，Chromas软件分析测序结果。(3)生化指标检测：采用高效液相色谱法(日本爱科来HA8180糖基化血红蛋白仪)检测HbA1c，采用美国贝克曼库尔特全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白(Apo)A、ApoB。试验均严格按照标准操作规程进行操作，采用高低2个水平配套质控品进行质量控制，所有生化项目均取得中华人民共和国国家卫生健康委员会和福建省临检中心室间质量评价合格证书。

2 结 果

2.14组一般临床资料比较 与对照组比较，T2DM组、CHD组、T2DM+CHD组年龄、体质量指数(BMI)、饮酒和吸烟人数，以及HbA1c、HDL-C、ApoA、ApoB水平差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2TCF7L2基因rs7903146位点基因型分析 经PCR扩增后，TCF7L2基因rs7903146位点基因片段为398 bp。将其DNA测序结果与GenBank参考序列比较，结果发现rs7903146位点存在2种基因多态性，CC基因型和CT基因型，未发现TT基因型，测序结果见图1。

2.34组Hardy-Weinberg遗传平衡分析 4组TCF7L2基因rs7903146位点多态性分布情况均符合Hardy-Weinberg平衡，对照组：χ2=0.066，P>0.05；T2DM组：χ2=0.222，P>0.05；CHD组：χ2=0.132，P>0.05；T2DM+CHD组：χ2=0.174，P>0.05)。所研究的基因型频数和预期的基因型频数相符合，具有群体代表性。

表1 4组一般临床资料比较

组别TC(x±s,mmol/L)TG(x±s,mmol/L)HDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)ApoA(x±s,mmol/L)ApoB(x±s,mmol/L)对照组5.00±0.771.27±0.371.37±0.343.04±0.791.51±0.261.09±0.25T2DM组5.15±1.581.96±0.09a1.03±0.29a3.23±1.221.07±0.23a0.90±0.27aCHD组4.89±1.431.50±0.33b1.01±0.25a3.19±1.371.08±0.19a0.90±0.28aT2DM+CHD组4.69±1.43b1.97±0.41ac0.88±0.19abc2.90±1.071.01±0.18ab0.95±0.33a

注：A为野生型CC基因型；B为杂合型CT基因型。

2.44组基因型频率分布比较 4组携带CT突变杂合子者29例，其中对照组5例，T2DM组9例，CHD组7例，T2DM+CHD组8例，4组基因型频率分布组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.54组不同基因型生化指标的比较 4组TCF7L2基因rs7903146位点各基因型间相关指标水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.6T2DM合并CHD的Logistic回归分析 将全部研究对象作为整体进行二分类Logistic回归分析二分类划分，将是否有T2MD合并CHD(否为0，有为1)作为因变量，其他指标作为自变量。结果显示，高龄、高水平HbA1c是发生T2DM合并CHD的独立危险因素，低水平HDL-C是预防T2DM合并CHD的保护因素。rs7903146位点基因型不是发生T2DM合并CHD的影响因素，见表4。

表2 4组基因型频率分布比较(n)

表3 4组不同基因型相关指标的比较

表4 T2DM合并CHD的Logistic回归分析

3 讨 论

与T2DM相关的基因中TCF7L2基因是研究较为深入的基因之一。TCF7L2作为Wnt/β-连环蛋白途径的核受体，在β-连环蛋白的诱导下结合基因中的Wnt反应元件[5]，β-连环蛋白与T细胞因子4形成复合物参与多种生物事件，特别是在胰腺和胰岛发育中起着关键作用[6]，这影响着T2DM的发生与发展。此外，Wnt信号可利用β-连环蛋白/T细胞因子4介导肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等多种靶基因的表达[7]，此类细胞因子可介导血管内皮炎性反应，促使血管壁增厚、管腔狭窄，从而增加心血管疾病的发病风险。

本研究通过对对照组、T2DM组、CHD组、T2DM合并CHD组TCF7L2基因rs7903146位点基因多态性分布分析发现，4组基因多态性分布差异无统计学意义(P>0.05)。此结果与陈铁晖等[8]结果相符。在此前亦有许多关于TCF7L2基因rs7903146位点基因多态性的研究，但其结论不一，梁伟等[9]研究认为TCF7L2基因rs7903146位点多态性TT+CT基因型、等位基因T是T2DM患者的危险因素；王志强等[10]研究新疆维吾尔族人群也认为该位点与T2DM有关联，CT基因型、T等位基因都是T2DM患者的危险因素，而也有学者研究该地区汉族人群则认为rs7903146位点基因多态性与T2DM不相关[11]；AXEL等[12]报道了奥地利人群中携带rs7903146 T等位基因的人群患CHD的风险较高，这种关联在T2DM患者中较强，而CORELLA等[13]报道未发现rs7903146位点基因多态性与心血管事件的相关性。研究结果不一致可能是因为每个研究中患者的人口统计学和临床特征不同，或者与不同环境因素有关。同时，不同种族及地域也有可能是其影响因素。在本研究中亦未发现研究人群 rs7903146位点基因多态性与T2DM合并CHD患者的联系。

TCF7L2基因是利用Wnt通路来调节肠内分泌细胞中的胰高血糖素，从而影响血糖的平衡，亦有研究认为，TCF7L2基因多态性与脂类代谢有关[14]。PALIZBAN等[14]研究发现当rs7903146位点C突变成T时，在血脂异常中将发挥重要作用。CORELLA等[15]研究发现肥胖人群与rs7903146位点基因多态性有相互作用，与不肥胖者比较，肥胖患者发生T2DM的风险更高。有研究表明rs7903146位点基因多态性可能与糖尿病肾病、高血压及血脂异常等发病机制有关[16-20]。赵晓宇等[21]报道在中国北方人群中 TCF7L2基因rs11196218位点A/G与血脂异常相关。因此，本研究还对各组CC、CT基因型的HbA1c和血糖、血脂指标进行比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究中Logistic回归分析结果显示高龄、高水平HbA1c是发生T2DM合并CHD的独立危险因素，低水平HDL-C是预防T2DM合并CHD的保护因素，rs7903146位点基因型不是发生T2DM合并CHD的影响因素。

本研究显示rs7903146位点各基因型生化水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但考虑到研究的样本量不够多，男女比例不平衡，组间年龄也有差异，且存在抽样误差的可能。因此，在评价结果时，需要考虑到这些因素不平衡带来的影响。此外，遗传背景、环境条件、生活方式、饮食习惯等诸多因素对疾病的影响亦不能忽视。

综上所述，TCF7L2基因rs7903146位点基因多态性与T2DM合并CHD发病风险、血糖、血脂水平无关。