VDR基因多态性与儿童慢性乙型肝炎的临床相关性分析*

黄彩芝，张 聪，唐 莲，莫丽亚

湖南省儿童医院：1.检验中心；2.肝病中心，湖南长沙 410007

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是全球性的重大公共卫生问题，每年约有一百万人死于HBV感染[1]。HBV感染后可导致慢性乙型肝炎(CHB)、肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌，儿童感染HBV后更容易发展为慢性感染，其中新生儿乙型肝炎慢性化率为80%～90%、小于6岁儿童乙型肝炎慢性化率为25%～30%，而成人乙型肝炎慢性化率不超过5%[2]。人类感染HBV的转归与病毒本身、环境、宿主免疫状态和遗传易感性等多种因素有关。有研究表明，维生素D受体(VDR)基因单核苷酸多态性(SNPs)与HBV宿主遗传易感性，HBV感染后的免疫调节、治疗反应、疾病进程及临床结局等密切相关[3-6]，但关于VDR基因SNPs与儿童CHB关系的相关报道较少。本研究通过观察CHB患儿VDR基因位点[BsmI(rs1544410)、ApaI(rs7975232)、TaqI(rs731236)、FokI(rs2228570)]的基因型和等位基因频率分布，初步探讨VDR基因SNPs与儿童CHB的遗传易感性、HBV基因型、肝脏病变严重程度及血清25羟维生素D[25(OH)D]水平的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016-2019年夏秋季节(每年5—10月)就诊于本院肝病中心的CHB患儿189例作为CHB组，其中男124例，女65例；年龄[61.00(37.50～97.50)]个月。纳入标准：(1)年龄为1个月至14岁；(2)CHB诊断符合中华医学会感染病学分会和肝病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[7]诊断标准。排除标准：(1)合并其他肝脏疾病、感染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、内分泌疾病、血液系统疾病、先天性免疫功能异常等；(2)入院前4周内服用维生素D制剂或免疫调节剂。

采用组织病理活检的方法衡量肝脏炎症活动度和纤维化程度[8]，根据肝脏病变严重程度将CHB患儿分为轻度组和中度组，根据HBV基因型将CHB患儿分为HBV B型组和HBV C型组。另选择同期在本院儿童保健所体检的健康儿童56例作为对照组，其中男36例，女20例；年龄[59.50(32.25～95.25)]个月。CHB组与对照组年龄(Z=0.648，P=0.517)与性别比较(χ2=0.033，P=0.855)，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得本院伦理委员会批准，所有入选儿童均征得监护人知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集和处理 采集CHB组和对照组儿童空腹静脉血3～4 mL，其中1 mL使用乙二胺四乙酸抗凝后用于DNA提取，2～3 mL未抗凝血分离血清用于HBV基因分型及25(OH)D水平检测。

1.2.2DNA提取 采用DNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)提取乙二胺四乙酸抗凝血液中的DNA，使用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度，置于-20 ℃保存备用。

1.2.3VDR基因SNPs检测 采用单碱基延伸技术通过多重PCR反应体系检测VDR基因位点BsmI(rs1544410)、ApaI(rs7975232)、TaqI(rs731236)、FokI(rs2228570)的多态性。PCR扩增仪为美国ABI公司提供的ABI Veriti DX扩增仪。BsmI位点的上游引物：TCT GAG GAA CTA GAT AAG CAG，下游引物：CAG GAA TGT TGA GCC CAG TT；ApaI位点的上游引物：GGA TAG AGA AGA AGG CAC AG，下游引物：CGG TCA GCA GTC ATA GAG G； TaqI位点的上游引物：GCT CCT GTG CCT TCT TCT C，下游引物：GAT GTA CGT CTG CAG TGT G；FokI位点的上游引物：GGT GGC ACC AAG GAT G，下游引物：CAA AGT CTC CAG GGT CAG G。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物纯化后行SNaPshot PCR扩增，扩增条件：96 ℃预变性10 s，96 ℃变性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，25个循环；最后4 ℃恒温。SNaPshot PCR产物纯化后经毛细管电泳，利用美国ABI公司提供的3500Dx基因测序仪完成位点测序，分析软件为GeneMapper 5.0。

1.2.4HBV基因分型 采用实时荧光定量PCR的方法，由金域医学检验所完成CHB患儿的HBV基因分型。

1.2.5血清25(OH)D水平检测 采用化学发光法，仪器和试剂为美国西门子ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂。

1.3统计学处理 使用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。非正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M(P25，P75)]表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU非参数秩和检验，多组间比较采用Kruskal-WallisH非参数秩和检验；对照组进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。计数资料以例数和百分率表示，采用χ2检验对组间基因型及等位基因频率进行比较，以比值比(OR)和95%置信区间(CI)表示暴露于某个基因型或等位基因后发生CHB或感染某种HBV基因型或较严重肝脏病变的危险性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1研究对象一般情况 CHB患儿中有139例进行了HBV基因分型，其中HBV B型组118例，HBV C型组21例；120例CHB患儿行B超引导下肝脏穿刺组织病理活检，经检查，肝脏炎症活动度情况为G1级53例、G2级25例、G3级42例；纤维化程度分别为S0期24例、S1期73例、S2期12例、S3期9例、S4期2例；其中78例患儿经组织病理活检诊断为轻度CHB(轻度组)，42例患儿经组织病理活检诊断为中度CHB(中度组)。

2.2CHB组与对照组VDR基因位点基因型与等位基因频率分布 经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，对照组儿童VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点基因型频率符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律(χ2=0.077、2.900、0.019、2.357，均P>0.05)，表明标本选取具有群体代表性。

位于VDR基因ApaI位点的基因型在CHB组和对照组间的频率分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)，CHB组的AC基因型(43.90%)频率分布高于对照组(26.8%)，提示与ApaI CC基因型比较，AC基因型可能增加儿童HBV感染的风险(OR=2.213，95%CI1.130～4.335)。而BsmI、TaqI和FokI 3个位点的基因型在CHB组和对照组中的频率分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。VDR 基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点的等位基因在CHB组和对照组中的频率分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3CHB患儿轻度组与中度组VDR基因位点基因型与等位基因频率分布 VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点的基因型和等位基因频率分布在轻度组和中度组CHB患儿中比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4CHB患儿HBV B型组与HBV C型组VDR基因位点基因型与等位基因频率分布 HBV B型组与HBV C型组CHB患儿中，VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点的基因型和等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 CHB组与对照组VDR基因位点基因型与等位基因频率分布[n(%)]

表2 CHB患儿轻度组与中度组VDR基因位点基因型与等位基因频率分布[n(%)]

续表2 CHB患儿轻度组与中度组VDR基因位点基因型与等位基因频率分布[n(%)]

表3 HBV B型组与HBV C型组VDR基因位点基因型与等位基因频率分布[n(%)]

2.5CHB患儿VDR基因位点不同基因型间血清25(OH)D水平比较 CHB患儿VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点不同基因型间血清25(OH)D水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 CHB患儿VDR基因位点不同基因型血清25(OH)D水平比较[M(P25，P75)]

续表4 CHB患儿VDR基因位点不同基因型血清25(OH)D水平比较[M(P25，P75)]

3 讨 论

VDR属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员，是存在于多种细胞核和细胞膜上的可溶性蛋白，主要分布于心、脑、肾脏、肝脏、皮肤等多种组织器官中，以及巨噬细胞、单核细胞、T细胞、B细胞等各种免疫细胞中，此外在许多肿瘤细胞中也发现了VDR的表达。VDR基因定位于12号染色体长臂，含427个氨基酸残基，相对分子质量为50×103。VDR通过调节靶基因转录介导活性维生素D发挥生物学效应，从而调节机体的固有免疫与适应性免疫反应。研究表明活性维生素D-VDR信号通路参与了涉及人体生理功能的900多种基因的表达与调控[9]，VDR基因多态性除了与钙磷代谢有关外，还与肿瘤、代谢性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病的病理生理机制密切相关[3,10-14]。目前已发现的VDR基因多态性主要集中在4个SNPs位点，分别为第8内含子的BsmI位点和ApaI位点、第9外显子的TaqI位点及第2外显子的FokI位点。

近年来VDR基因SNPs与CHB关系的研究日益受到重视，VDR SNPs可以改变其编码的VDR蛋白质的结构与生物学功能，HBV可能通过下调VDR的表达水平阻止活性维生素D对HBV转录与翻译的抑制作用[4]，同时VDR与活性维生素D结合后可抑制1型辅助性T细胞的增殖与细胞因子的分泌，并激活2型辅助性T细胞的应答从而调节机体的免疫功能[15]，而CHB患者HBV的清除主要依赖于以1型辅助性T细胞应答为主的细胞免疫反应，因此VDR基因的不同表达可能与HBV易感性及疾病进程有一定的相关性。有研究指出，携带VDR FokI基因型CC、CT及等位基因C的个体具有更高的HBV易感性，CT与TT基因型的CHB患者对聚乙二醇干扰素的治疗反应更强，FokI基因SNPs可作为HBV感染后预示肝细胞癌发生风险、评估疾病严重程度的分子标志物[3,5,16]；TaqI TT基因型和T等位基因与无症状HBV感染有关[17-18]；ApaI AA基因型与CHB患者高病毒载量和肝病严重程度相关[18]；BsmI BB基因型与HBV感染转归有一定的联系[19]。而HE等[3]的Meta分析研究表明，BsmI、ApaI、TaqI位点的多态性与HBV易感性并无联系，HOAN等[6]的研究亦指出，VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点的多态性均与HBV感染风险无关，但ApaI位点的多态性与HBV感染患者的临床结局和疾病进展相关。本研究中VDR基因BsmI、TaqI和FokI 3个位点的基因型和等位基因频率在CHB组和对照组、CHB轻度组和中度组中的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，而ApaI位点的基因型频率分布在CHB组和对照组中的比较，差异有统计学意义(P<0.05)，CHB组的AC基因型频率分布高于对照组，提示与ApaI CC基因型比较，携带AC基因型的儿童可能有更高的HBV感染风险(OR=2.213，95%CI1.130～4.335)，但ApaI各基因型在不同严重程度CHB患儿中的频率分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明VDR基因SNPs可能与CHB患儿肝脏病变严重程度无关。上述研究结果不一致的原因可能与种族差异、地域环境差异、受试人群生活方式特征，以及研究方法和样本选择的不同等有关。

HBV有多个基因型，我国以B基因型和C基因型为主[7]，HBV基因型与疾病进展和干扰素治疗应答有关，HBV e抗原阳性者B基因型对干扰素-α治疗的应答率高于C基因型[20]。本研究中HBV B基因型和C基因型的CHB患儿VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点的基因型与等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示VDR基因SNPs可能与HBV B基因型或C基因型的易感性无关。另外本研究还发现，CHB患儿VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4个位点不同基因型间的血清25(OH)D水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，表明VDR基因SNPs在调控25(OH)D生物学功能的同时，可能并不影响血清中的25(OH)D水平，与相关研究一致[6]。本研究中与病例组比较，对照组儿童样本量较小，存在一定的局限性，另外本次单中心研究未纳入组织病理活检诊断为重度CHB的患儿，可能导致研究结果不全面，有待进一步的多中心扩展研究与验证。

综上所述，本研究结果表明，VDR基因ApaI(rs7975232)位点多态性可能与儿童CHB易感性相关，携带AC基因型者发生HBV感染的危险性增高；未发现VDR基因位点(BsmI、ApaI、TaqI、FokI)多态性与CHB患儿肝脏病变严重程度、HBV基因型及血清25(OH)D水平的相关性。