新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

周思汝

摘要：目的：研究新型阳离子核酸载体的细胞转染效率。方法：运用MTT比色法对DNA和LW13-2不同比例下的细胞毒性进行分析;在荧光显微镜下对转染效率进行计算。结果：LW13-2细胞存活率会伴随着DNA比例的增加而降低。DNA在转染复合物中的含量较少，DNA和LW13-2质量比为1：1、2：1、3：1，细胞存活率均在90%以上;当DNA：LW13-2为1：3时，转染率最高能够达到88.6%。转染率下降，DNA：LW13-2为1：5～6，促使大量细胞破碎和死亡。结论：将新型的阳离子脂质体核酸载体LW13-2应用到体外核酸转染中，展现出了较强的优势，为后续的基因治疗研究工作提供了载体系统。

关键词：细胞转染;阳离子;核酸载体

【中图分类号】 R254    【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2021）17--01

阳离子核酸载体作为基因治疗中一项新型的治疗技术，通过将适宜的载体导入到靶细胞中，有助于确保基因的持续性和稳定性。核酸传递载体自身具有较强的应用价值，其在实际的使用过程中，展现出了较强的治疗效果及治疗质量，是一种关键性的治疗因素，通过与各种材料及基团有机的组合在一起，形成一种新型的核酸载体，被广泛应用于医学领域中，成为医学行业的热点研究问题。

1资料及方法

1.1一般材料

1.1.1实验材料

新型核酸载体材料LW13-2作为本次实验的主体材料，该材料在实验中保存，在大肠杆菌DH5中扩增，QIAgene质粒主要是从试剂盒中提取出来，在0.22μm微孔来完成除菌，放在-20℃下进行保存。所有的细胞均使用10%胎牛血清的DMEM进行培养。

1.1.2实验仪器

CO2培养箱、酶标仪、倒置荧光显微镜、超净工作台。

1.2方法

1.2.1LW13-2细胞毒性测定

运用LW13-2对细胞的毒性进行测定，运用MTT比色法来进行测定，将HEK293细胞种入到96孔的细胞培养板中，其中含有100μL10%的FBSDMEM，5%的CO2，培养的时间控制在24h，在37℃下进行培养。LW13-2和Li-po2000各100μL，将以上两种物质溶解在PBS中，并将配成不同比例的转染试剂加入到各细胞孔中，取4个复孔的平均值。在对照孔中培育PBS溶液，培养的时间控制在24h。将5mg/mL的MTT溶液50μL加入到孔中，在37℃下培养4h，确保MTT能够还原为甲瓉，将培养板中的所有液体轻轻弃去，可见在细胞內形成甲瓉结晶。为了使甲瓉结晶能够快速溶解，需要将150μL二甲基亚砜DMSO加入进去，振荡10min。使用酶标仪来测定波长吸光值，对细胞的存活率进行计算，计算方法为：细胞存活率=（试验组吸光度/对照组吸光度）100%。对计算结果进行分析可知，细胞存活率与细胞的毒性呈正相关关系，当细胞的存活率≥90%时，则可判定为低细胞毒性[1]。

1.2.2细胞转染操作及转染效率测定

取6只EP管，分别加入到EGFP质粒DNA5μ中，按照阳离子转染试剂方法加入，依次加入LW13-2和转染复合物悬液，将液体放置在温室中5min，之后将事先准备好的96孔细胞加入到细胞培养皿中，完成转染实验，之后对5%CO2放置在37℃条件下继续培养，对转染效率进行计算。

1.2.3血清对基因转染效率的影响

细胞准备工作如前，按照3：1的质量比来准备转染复合物，分别加入5%、10%的复合物溶液及无血清DMEM，对液体进行轻轻混匀，将其放置在温室内，时间到达5min后，再将其加至到细胞上。

1.2.4培养时间对基因转染效率的影响

转染复合物的质量比控制在3：1，细胞准备工作如前所示，待作用4h后，弃转染液，将含有10%的FBS加入到DMEM中，继续进行培养，培养时间为8、12、24和48h时，对细胞的生长情况进行观察，并计算出与GFP荧光细胞的比例。

2结果

2.1细胞毒性测定

在细胞液中加入不同浓度的转染试剂，细胞培养的时间控制在24h。测定结果显示，LW13-2细胞存活率会伴随着DNA比例的增加而降低。DNA在转染复合物中的含量较少，DNA和LW13-2质量比为1：1、2：1、3：1，细胞存活率均在90%以上。将0.8μgDNA和2μLLipo2000，形成转染复合物，作用的时间控制在24h后，可知细胞的存活率在96.3%以上，与LW13-2的转染复合物质量相比，两者之间的细胞毒性水平较为接近，不会对细胞活力造成较大的影响。

2.2不同因素对LW13-2基因转染效率的影响

通过显微镜进行观察，对不同比例的质粒及新型核酸载体混合物进行细胞转染，在48h后进行观察，发现细胞体内出现了明显的绿色荧光，说明这一新型的核酸载体自身具有良好的转染活性。并且荧光的强度也会随着LW13-2含量的增加而增强。转染率最高能够达到88.6%，当DNA：LW13-2为1：3时所表现出来的。转染率下降，DNA：LW13-2为1：5～6，导致转染率急剧下降，促使大量细胞破碎和死亡。

3讨论

在本次实验中，通过对新型的阳离子脂质体核酸载体LW13-2进行合成，完成了对阳离子的改造和选择，增加了核酸载体细胞的靶向性，确保了基因治疗工作的发展。对转染效果的影响因素进行分析，可知质粒DNA和阳离子脂质体时重要因素，通过将两者混合，促进了脂质体的形成，核酸物质形成于囊泡结构中，避免核酸酶发生降解。在不含血清的情况下，转染效果最好，说明LW13-2在基因转染实验中取得了较好的转染效率。转染试剂Lipo2000作为一种阳离子脂质体，被广泛应用于体外基因转染中，在本次实验中，主要采用对比试剂研究的方式，对新型的阳离子脂质体核酸载体转染效率进行计算。实验结果表明LW13-2与Lipo2000具有相同的细胞毒性，细胞的整体存活率均在90%以上，DNA的转染率高于Lipo2000，两者之间差异性显著。将新型的阳离子脂质体核酸载体LW13-2应用到体外核酸转染中，展现出了较强的优势，为后续的基因治疗研究工作提供了载体系统[2]。

参考文献：

[1]尹亚军，李蕊清，刘欢，田蕾铭，张力瑞，张辉，路宏朝，张涛.高分子聚合物对两种细胞转染效率的研究[J].陕西理工学院学报（自然科学版），2016，32（01）：64-69.

[2]王偲颖，林靖，韩媛媛，张华，黄盛文.阳离子脂质体介导肽核酸转染K562细胞的研究[J].贵州医药，2016，40（04）：341-343.