浅谈高效液相色谱法测定食品中着色剂的注意事项

龙起成

摘要：在实验室利用高效液相色谱法检验着色剂的过程中，通过对试剂、前处理、色谱仪等条件的优化，能够大大提高测量的精确性。

关键字：高效液相色谱法、食品检验、着色剂

着色剂所为一类常用的添加剂被广泛的应用于各种食品之中，增加食品感官卖相的同时也需要严格的控制添加量，保证实用后不会对人体产生影响。GB5009.35-2016、GB/T 21916-2008、GB/T 9695.6-2008等标准都对常见的食品中着色剂的检测步骤进行了标准化的阐述，本人通过多年的食品检测经验，以GB5009.35-2016为例现总结出以下几点对不同基质产品的着色剂检测过程中的注意事项：

第一是要注意的标准适用范围，GB5009.35-2016适用于饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力豆及着色糖衣制品，所以对于其他基质的食品可以参考标准的思路，但不能作为判定依据，尤其在出具报告时一定要告知委托检验人是检定报告还是测试报告，避免出现超范围情况的发生。

第二是试剂的配制问题。标准中没有给出试剂配置后的保存期限，可以参考理化检测对试剂的保存时间，但对于高效液相色谱检测来说，最理想的方法还是现用现配。尤其是流动相，必须是现用现配，切不可使用存放了多日之后的流动相，高效液相色谱以其精密的检测而被广泛应用，其内部管路极其细小，而存放了多日的流动相尤其是水相为主的流动相大部分会产生浑浊甚至沉淀，杂菌滋生，这对精密而细小的仪器管路是致命的，一旦出现堵塞，疏通起来会很繁琐，同时长期使用即使不出现堵塞，对色谱柱的寿命也会产生影响。而纯有机相的流动相相对保存时间可以长一些，但是需要注意的是密封问题，要防止挥发和粉尘的进入。由于是梯度洗脱，我们无法配制特定浓度的混合流动相进行使用，但是一定要注意的是对于流动相一定要过膜、超声。这两部对仪器的保护、数据的准确至关重要。尤其如果使用特定比例的有机无机混合溶液作为流动相的时候一定要进行超声。有机相和无机项混合的时候会产生大量的气泡，这些气泡是肉眼无法看到的，只有超声才能赶出气泡，在仪器使用过程中不至于因为产生气泡而影响基线稳定和峰型的准确。

第三是标准品的配制和保存。标准品的量取要用大肚吸管，切不可图省事用移液枪，注意大肚吸管最后半滴的取舍问题。对于保存，一定按照要求贴好标签存放，在有效期内使用，需要注意的是如果标准品冷藏保存了，在使用时一定要和进样样品恢复到相同的温度进样，由于进样一般都是以微升为单位，所以尽量避免温度差带来的进样体积差距。高效液相色谱检测以外标法定量，所以标准品的准确与否至关重要，对于标准品的配制和保存，一定要加大重视程度，如果起步就错，后边的也就无意义了。

第四是样品的前处理。对于样品的称量问题，一些刚刚走进检测岗位的检验员往往会犯的错误就是比较随意或者按以往经验称量差不多的样品量。这里需要提示的是，每个标准中对称样量的限定不是随意的一个数值，标准中规定的称样量对整个试验的限定数值。换句话说用标准中的前处理就需要准确按标准中规定的样品量进行提取分析，太多可能超过了本实验的提取范围，太少又可能会带来较大误差量。所以对于样品的称样量我们一定要严格按照标准中的范围，不同基质按不同的称样量进行试验。样品的制备在标准中写的比较详细，在此不再赘述，需要注意一点就是要尽可能的提取充分，尤其是巧克力豆及着色糖衣，一定要水洗充分，不要在意水洗后溶液的多少，水相在后边是会过滤舍去的，不必在意多少。着色剂的提取按聚酰胺提取法进行提取，这里需要注意的是在加聚酰胺粉的时候一定要按要求把样品提取液加热到60℃左右，因为有的实验室保温条件不是很好，过低的温度会影响聚酰胺粉对着色剂的吸附，可能会等很久才会吸附好，为了提高试验效率，我们加热到60℃加入聚酰胺粉会很快完成吸附。之后按标准要求进行洗涤、洗脱。在洗脱时第一次加入乙醇-氨水-水溶液时可以适当多加一些，多搅拌静止一会儿，不要着急开泵进行抽滤，因为在洗脱时第一次往往需要时间，然后分多次少量的加乙醇-氨水-水溶液，直至G3漏斗中的聚酰胺粉呈现白色即可。水浴加热浓缩的时候注意温度，避免溶液沸腾。定容时需要注意的是一定要冷却至室温再定容，切不可带温进行定容，热胀会带来数值的不准确。

第五是前处理的一些玻璃器皿要及时清洗。尤其是G3漏斗，因其本身特性，最好是使用完就及时冲洗干净，用稀盐酸浸泡超声清洗后干燥保存。

第六是上机分析。在样品进仪器分析前要充分平衡色谱柱，可以观察以下色谱图：

对着色剂这种需要流動相梯度洗脱的检验项目，我们一定要在平衡色谱柱的时候按其洗脱梯度进行平衡，充分的冲掉色谱柱中的杂质影响，这样才能做出干净漂亮的色谱图来。最常见的就是如果不能充分平衡色谱柱，那么基线会忽高忽低极其不稳。对于柱温箱温度国标中有明确的数值35℃，这里需要注意的是实验室的温度，多年的经验来看，比柱温箱低5-10℃的恒定温度更有利于图谱的稳定，也就是说环境温度让仪器柱温箱持续做功保持恒温比较好。

最后提醒一下有的领导可能在定性试验中要求某几个样品混在一起进行检测，将样品混合后按标准进行称量、提取等操作，如果未能检出相应参数，就认为这几个样品中没有此物质。这是一个典型的稀释和浓缩概念混淆不清的例子，我们的检验项目都有检出限，低于检出限我们认为是未检出。举个例子来说有9杯水1杯待测物，假设我们的检出限为50%，也就是说当待测物和水各一半时是我们检出的极限浓度，但是如果按照混合样品9杯水和1杯待测物来说，待测物浓度为10%，这就低于50%的检出限，我们可能会认为是10个样品都不含待测物，然而实际上是有待测物的，这就是一个典型的稀释后没有浓缩的实验过程，因此在检测过程中我们一定要注意这种情况的发生。这种混合称量样品如果非要这么取样，一定要算好稀释倍数，在最后一定要浓缩回来，只有这样才能保证数据的准确。

高效液相色谱法检测着色剂在众多的检测指标之中算是比较简单易学又非常典型的试验。其中需要总结的技巧和经验也很多，需要在日常的工作中不断发现总结，对比不同方法的指导思想来思考每一步骤的具体用意，注意每个细节，必定会让检测结果更趋于真实值。

参考文献

[1]中华人民共和国国家标准，GB5009.35-2016 食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定.