弓形虫基因缺失疫苗研究进展

李龙娇

（重庆三峡职业学院，重庆404020）

刚地弓形虫作为寄生原虫之一，可感染包括人在内的多种温血动物。弓形虫疫苗一直被认为是防治弓形虫病最有效的手段之一，目前基于虫体基因缺失的弱毒疫苗研究较为广泛[1-3]。本文主要就弓形虫基因缺失疫苗的最新研究进展，对作为疫苗候选的弱毒虫株的潜力和发展方向做简要介绍，以期为研制安全有效的弓形虫疫苗提供一定参考。

弓形虫病作为人兽共患寄生虫病之一，可感染多种畜禽。猪弓形虫病在全世界范围内均有流行，妊娠猪感染后出现高热、厌食、流产等症状，同时虫体可经胎盘传播给仔猪，进而影响仔猪的生存和生产，给养猪业带来损失。更为严重的是，它可感染有免疫缺陷的人群，造成脑炎、视网膜炎等疾病；同时弓形虫感染可致妇女在妊娠期间出现流产、产死胎或畸形胎。多年以来，弓形虫病严重威胁着世界各国畜牧业的发展和公共卫生安全。而目前研发出良好的弱毒疫苗被认为是有效预防弓形虫病的最佳策略。

1 基因缺失虫株的意义

近年来，分子生物学领域得益于高效的基因编辑技术（如Cre-loxp、CRISPR/Cas9技术等）及其迅速发展，尤其是CRISPR/Cas9作为第三代基因编辑技术已被开发为可以在任何遗传背景下进行高效率的定点基因编辑，其对于DNA编辑和调控条件基因的表达有着显著的优势。在此背景下，基因缺失虫株便是运用基因编辑技术对弓形虫的毒力或代谢基因进行敲除，其目的是希望敲除毒力或代谢基因后的虫株仍保留有免疫原性，可以刺激机体产生特异性免疫应答反应但却失去致病力，进而为弱毒虫株疫苗的开发提供参考。

2 基因缺失候选虫株

2.1 GRAROP蛋白家族基因缺失虫株

致密颗粒蛋白家族（GRAs）和棒状体蛋白家族（ROPs）是弓形虫重要的分泌蛋白，不仅与虫体入侵、逃逸等过程密切相关，同时还是纳虫泡的重要组成成分。有研究表明，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对GRA17基因进行敲除，成功构建了PruΔGRA17虫株，发现该基因敲除虫株可以诱导小鼠产生高水平体液免疫，降低野生型RH虫株、Pru虫株对小鼠的感染。对GRAs新成员TGGT1_319340进行基因敲除后，发现虫体的生长受到了较大抑制。另外有学者发现，GRA12的缺失会影响虫株的致病力，若将GRA12和ROP18或者ROP5和ROP18联合敲除，形成的RHΔGRA12ΔROP18虫株、RHΔROP5ΔROP18虫株感染小鼠后致病力显著降低。不仅如此，在Ⅱ型虫株ME49中同样发现ROP5和ROP18缺失后接种小鼠，可以增加小鼠的存活率。

2.2 CDPK基因缺失虫株

钙依赖蛋白激酶家族（Calcium-dependent pro⁃tein kinases，CDPKs）广泛存在于植物和顶复门寄生虫中，调节着胞内外钙离子信号通路。研究表明，CDPKs调节着弓形虫虫体滑行、入侵和溢出等多个重要过程，其中CDPK2是支链淀粉代谢中必须的调节因子，对弓形虫缓殖子的发育具有重要的作用。有学者利用CRISPR/Cas9技术对Pru虫株CDPK2基因进行敲除后，发现PruΔCDPK2虫株接种的小鼠产生了高水平的免疫保护力，可以显著降低Ⅰ型虫株对小鼠的致死率。尽管CDPKs中还有不少成员都得到了功能鉴定和基因缺失虫株的构建，但目前PruΔCDPK2虫株是最具有疫苗开发潜力的基因缺失虫株。

2.3 糖代谢基因缺失虫株

在弓形虫的糖代谢途径中，糖酵解途径在速殖子和缓殖子时期都有所表达。前期研究发现，糖酵解途径中有两个催化丙酮酸与乳酸进行相互转化的关键酶，分别是乳酸脱氢酶1（LDH1）和乳酸脱氢酶2（LDH2）。在ME49虫株中对LDH1基因敲除后，虫体的毒力和形成包囊的能力降低；而对LDH1和LDH2同时进行敲除后，发现ME49ΔLDH虫株虽然可以在体外进行生长，却无法在体内进行繁殖。在后续的小鼠免疫评估试验中又发现，ME49ΔLDH可诱导产生高水平免疫球蛋白G（IgG），有效抵抗RH、ME49等野生型虫株的感染，及时清除感染虫体。不仅如此，ME49ΔLDH虫株在免疫接种的早期可诱导高水平的细胞免疫，使宿主产生抵抗弓形虫的主要细胞因子γ干扰素（INF-γ）。接种了ME49ΔLDH虫株的小鼠，脾细胞还产生了高水平的细胞因子，如INF-γ和α肿瘤坏死因子（TNF-α）。

3 小结

由于近年来基因编辑技术的广泛应用以及取得的显著的成果，学者们已将其用于弓形虫弱毒疫苗的研究中。良好的弓形虫弱毒活疫苗不仅可以诱导机体产生有效的免疫保护力，抵抗不同阶段的野毒虫株感染，并且不会在机体内残留免疫虫体，因此不会存有任何返毒和散毒的风险。

目前弓形虫弱毒疫苗的研究常用的虫株如T-263，可以抑制终末宿主猫体内卵囊的形成；S48虫株可以在一定程度上预防弓形虫引起的妊娠母羊的繁殖障碍。虽然传统的弱毒虫株可以刺激机体产生一定的免疫保护力，但其预防的动物范围和虫体发育阶段具有局限性，并且存在有返毒甚至传播弓形虫等诸多风险。为解决上述问题，弱毒虫株的研制转向基因缺失虫株的构建，此系列虫株具有免疫原性好、遗传改造针对性强的特点。相信结合未来更为稳定高效基因编辑技术，研制出遗传稳定、安全有效、应用性强的基因缺失疫苗指日可待。