Cx43缝隙连接蛋白羧基末端磷酸化修饰对其功能的调控及其在脑缺血中的研究进展

左夏林 唐艳艳 李孔平 彭林辉 徐恩

广州医科大学神经科学研究所，广州医科大学附属第二医院神经内科（广州 510260）

连接蛋白（connexin，Cx）构成的细胞间缝隙连接（gap junction，GJ），通过相邻细胞之间的物质、能量交换及电、化学信号耦合，可以创建独特的细胞信号传导网络，形成缝隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）。GJIC在神经系统细胞生长、分化以及迁移等生理、病理过程中具有重要作用［1］。在人类连接蛋白家族的21个成员中，连接蛋白43（connexin 43，Cx43）是机体内分布最为广泛，研究最为成熟的连接蛋白家族成员。Cx43合成于内质网核糖体，并在高尔基体内寡聚化，形成由6个连接蛋白组成的半通道，然后转运至细胞膜聚集形成GJ。Cx43的磷酸化修饰主要发生在细胞质的羧基末端（carboxyl terminal，CT），它通过调节Cx43的折叠、运输、积聚、对接和降解，进而直接或间接影响GJJC［2-4］。本文主要对Cx43的CT磷酸化修饰调控Cx43蛋白功能及其对GJIC的影响以及Cx43在脑缺血中的作用进行综述。

1 Cx43的结构特点及生理功能

Cx43由382个氨基酸组成，含有四个α-螺旋跨膜结构域。Cx43从N端至C端出入细胞膜共四次，形成两个细胞外环（extracellular loops，EL1、EL2），一个胞质环（cytoplasmic loop，CL），以及朝向细胞质的 N-末端（amine terminal，NT）和 C-末端［5］。Cx43处于动态变化过程，半衰期大约1.5～5.0 h，它首先在内质网核糖体上合成，然后被运输到高尔基复合体，最后在细胞膜上聚集形成Cx43半通道。两个Cx43半通道在细胞膜相互锚定后对接在一起，形成一个直径约1.5～2.0 nm的亲水性通道，即GJ。Cx43形成的GJ通道允许分子直径＜1.5 nm和分子量＜1.2 kDa的小分子物质通过，如无机离子（Na+、K+、H+等）、代谢物、第二信使（如Ca2+、cAMP、cGMP、IP3）、micro RNA和其他信号分子［6-7］。多个GJ聚集在一起，形成斑片状，GJ斑的数目决定了细胞间通讯功能的差异。相邻细胞间通过GJ所介导的GJIC进行着信号传递、物质及能量交换，对细胞的内环境稳定、新陈代谢、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用［8-9］。在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中，各种类型神经细胞之间存在着不同类型的GJ，使得神经细胞间形成高度互连的网络。星形胶质细胞的GJ允许离子和代谢物快速在细胞之间交换，对K+和谷氨酸的缓冲，Ca2+波传播和突触可塑性至关重要［10-11］。未配对形成GJ的Cx43连接蛋白可以作为半通道，负责向细胞外环境释放包括ATP、谷氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和D-丝氨酸等胶质递质［12］，从而对神经元和神经胶质细胞之间的营养物质代谢和电信号传导起重要作用。

2 Cx43羧基末端磷酸化修饰在其缝隙连接中的作用

作为相对保守的基因和蛋白质家族，Cx43之间的区别主要在于胞质CT的长度和序列。Cx43 CT是Cx43序列上长约150个氨基酸，占整个Cx43蛋白的39%。Cx43 CT富含脯氨酸和丝氨酸的成分，使得CT成为蛋白质相互作用和蛋白激酶的潜在靶标，对于调控GJIC的功能至关重要［13］。Cx43蛋白的CT肽链包含了复杂的磷酸化位点，是Cx43磷酸化的主要区域。在稳态细胞的生命周期中，Cx43 CT的磷酸化状态除了快速调节通道的开放/闭合状态，还可通过影响Cx43的合成、转运、聚集/解聚和降解等不同环节［14-20］，改变活化通道数量，最终实现对缝隙连接功能的调控。例如，在体外培养的HeLa细胞中，转染了Cx43 CT突变体后，与正常Cx43 CT相比，Cx43转运到细胞膜形成GJ的效率明显下降［21］。PKA通过与Ezrin蛋白形成复合物，靶向调控Cx43 CT的Ser369和Ser373位点，刺激cAMP生成进而增强细胞间的GJIC［22］。SLAVI等［23］将出生后7～12 d的小鼠放置于75%氧气中5 d诱导视网膜病变，缺氧后虽未观察到视网膜处Cx43半通道的开放，却发现星形胶质细胞之间的GJ偶联增加。导致这一现象的原因是酪蛋白激酶1δ（casein kinase 1delta，CK1δ）使 Cx43 Ser325/328/330位点磷酸化，加速Cx43半通道装配成GJ斑，导致星形胶质细胞之间的GJ偶联增加。

Cx43 CT的磷酸化修饰除了使GJIC增强，也可抑制GJIC。有研究表明，病毒癌基因编码的蛋白酪氨酸激酶v-Src使Cx43 CT中Tyr247和Tyr265位点的磷酸化，从而抑制GJIC［11］。一方面原癌基因编码的c-Src蛋白通过激活G蛋白偶联受体来破坏细胞间的GJIC［24］，另一方面通过c-Src SH2结构域与Cx43 Tyr265相互结合并使Cx43磷酸化后，抑制Cx43和紧密连接蛋白1之间的内源性相互作用，从而抑制GJIC［25］。细胞生长因子诱导的GJIC抑制过程同样也受到Cx43 CT磷酸化修饰的影响。例如表皮生长因子通过MAPK介导的Cx43 Ser255，Ser279 和 Ser282 处磷酸化而快速抑制 GJIC［26］；血小板衍生生长因子诱导的GJIC抑制涉及MAPK和PKC信号通路的激活［27］。

3 Cx43及其缝隙连接通道在脑缺血中的作用

3.1 Cx43在脑缺血中的变化 Cx43是脑组织中含量最丰富的缝隙连接蛋白之一，是星形胶质细胞通过形成缝隙连接和半通道发挥各种生理功能所必需的，在脑缺血发生发展中的作用受到越来越多的关注［28］。在光化学诱导的大鼠皮质缺血模型中，缺血后1 d，梗死周围感觉皮质Cx43 mRNA水平减少；而缺血后3～7 d，Cx43 mRNA水平逐渐升高。免疫组化显示缺血后1～14 d，Cx43免疫活降低；缺血后30～120 d，Cx43免疫活性恢复至缺血对侧部位水平［29］。LI等［30］发现在大鼠全脑缺血10 min再灌注4～48 h后，海马CA1 Cx43蛋白水平降低。然而，目前的研究数据表明，缺血后脑内Cx43的变化不尽相同。在小鼠大脑中动脉永久性闭塞后2 h和3 h，皮质核心缺血区Cx43蛋白表达显著增加；然而，在6 h后Cx43水平显著降低，这种减少可能是由于缺血区域的细胞死亡伴随Cx43的降解［31］。在低氧/脑缺血损伤新生鼠中，缺血脑组织Cx43在低氧/脑缺血损伤后4 h升高，在低氧/脑缺血损伤后7 d进一步升高，总Cx43水平几乎升高18倍，表明Cx43在脑缺血损伤病理生理过程的早期（24 h内）和晚期（24 h至数周）都发挥作用［32］。Cx43在缺血性卒中后的变化，可能与缺血的时间、缺血的部位以及组织损伤的程度有关。此外，很多研究只是观察总的Cx43水平，并未观察Cx43的磷酸化水平变化。

3.2 Cx43及其缝隙连接在脑缺血中的作用 Cx43在脑缺血中的作用仍存在争议。在特异性敲除星形胶质细胞Cx43的小鼠中发现，与野生型小鼠相比，Cx43（+/-）小鼠大脑中动脉远端闭塞后4 d缺血半暗带区神经细胞凋亡加剧，小鼠脑梗死体积增大［31］。笔者认为Cx43（+/-）小鼠大脑中，缺乏Cx43的星形胶质细胞可能无法通过缝隙连接从缺血核心病变中清除细胞毒性物质和凋亡起始因子，从而导致Cx43（+/-）小鼠表现出严重的脑卒中病变，这表明星形胶质细胞之间的GJIC在缺血损伤的病理过程中发挥着重要作用［33］。Cx43除了形成细胞间缝隙连接外，未形成缝隙的连接蛋白还可能形成半通道，运输释放ATP、谷氨酸和谷胱甘肽等物质到周围环境。LIN等［34］发现在小鼠的大脑中动脉闭塞模型中，低氧预处理具有神经保护作用，敲除Cx43的小鼠模型则对低氧预处理不敏感。结果显示低氧预处理减少了Cx43的降解，导致质膜Cx43半通道的数量显著增加，ATP通过半通道外流导致其分解代谢产物腺苷的积累，从而达到神经保护作用。有研究显示Cx43的神经保护作用主要受它的CT区域调节，Cx43 CT的磷酸化位点在缝隙连接组装和活性中起重要作用。在截断Cx43 CT258位残基的突变小鼠中，截断CT段这个区域可以去除CK1、PKA、PKC和多数MAPK磷酸化的位点；同时与Src、PDZ zona occludens 1结合的区域也被去除［35］。研究结果显示，与野生型小鼠大脑中动脉闭塞模型相比，Cx43 CT区域突变导致小鼠大脑中动脉闭塞模型梗死体积更大，皮层梗死半暗带区域星形胶质细胞增生减少，小胶质细胞数量增加。同时，与野生型小鼠相比，Cx43 CT区域突变导致小鼠皮层Cx43蛋白表达降低；此外，Cx43 CT区域突变形成缝隙连接通道减少，半通道活性降低［35］。

然而，也有学者认为Cx43半通道是“病态孔”，在细胞应激异常时开放［36-38］；当致病因子在应激细胞中积累时，可通过缝隙连接实现从细胞到细胞的扩散，影响疾病病理改变，促进损伤的扩散。有研究证明刺激诱导Cx43半通道开放后，可导致神经毒性物质释放［28］。在大脑缺血条件下，受损神经元释放出大量的ATP，在缺血性半暗带区，从缺血核心区域星形胶质细胞Cx43半通道释放的ATP将诱导神经元的进一步损伤［39］。FRANTSEVA等［40］在体外缺血模型中研究发现将海马切片浸入缺氧-低糖的培养基中48 h后，用反义寡核苷酸抑制Cx43的表达可显著减少缺氧-低糖诱导的神经细胞死亡。XIE等［41］在大鼠MCAO模型证实脑缺血后3 d和7 d海马Cx43表达明显上调，通过下调Cx43可显著增加海马锥体神经元的存活率并改善行为学评分，减轻梗死同侧海马的萎缩。LI等［32］的研究发现，在低氧/脑缺血损伤新生鼠中，缺血脑组织Cx43蛋白水平增加；抑制Cx43缝隙连接可以显著缩小梗死体积，减轻缺血皮层和纹状体胶质细胞的激活，恢复其缺血后的神经功能。在小鼠大脑中动脉闭塞模型中，阻断Cx43半通道可以缩小小鼠皮层梗死体积；同时，敲除MAPK激酶位点的Cx43S255/262/279/282A（MK4）也可以导致皮层缺血区域星形胶质细胞Cx43半通道活性降低，缩小小鼠皮层梗死体积［42］。因此，细胞缝隙连接允许细胞毒性物质通过，也将所需的物质传递到需要的区域，同时也缓冲兴奋性氨基酸和离子的细胞毒性水平。这两种理论可能都是正确的，而决定缝隙连接是保护性还是破坏性作用的关键因素可能取决于脑缺血部位正常细胞与损伤细胞的比例。

4 调控Cx43在脑缺血防治中的可能策略

越来越多的研究提示，Cx43在脑缺血损伤中发挥着重要的作用。由于干预Cx43的表达及其形成的缝隙连接可能影响脑缺血的预后，Cx43被认为是治疗脑缺血的潜在干预靶点。例如，甘珀酸是一种非特异性的Cx43半通道阻滞剂。已有研究表明，在氧糖剥夺/复氧的细胞损伤模型中，星形胶质细胞半通道活性升高，广泛释放谷氨酸，从而增加活性氧（ROS）的产生，最终导致细胞死亡。而甘珀酸的加入，可以阻断谷氨酸的释放、增加兴奋性氨基酸转运体1的水平和下调谷氨酰胺的表达［43］。此外，甘珀酸可以抑制Cx43半通道开放和ATP的释放，并将激活的小胶质细胞的表型从M1转换为M2，从而在缺血性卒中后提供有效的神经保护［44］。

Cx43模拟肽是以GJ的胞外环或胞内环为靶点的一段碱基序列，包括Gap19、Gap26、Gap27等，可以作为Cx43半通道阻滞剂。Gap26、Gap27对应于Cx43的胞外环中的一段序列，可抑制Cx43缝隙连接通道的形成。新生大鼠脑缺氧/缺血损伤后8小时至7 d，缺血部位Cx43的表达持续增加。在模型制备前1 h腹腔注射Cx43模拟肽Gap26（10，25，50 μg/kg）或Gap27（25 μg/kg）可显著缩小脑梗死体积。缺血后24 h腹腔注射Gap26（25 μg/kg），改善了新生大鼠运动协调和促进空间记忆能力的功能［32］。Gap19对应于Cx43的胞内环中的一段序列，可能干扰Cx43的C-末端尾部和CL的相互作用。有研究表明，Gap19可以缩小小鼠大脑中动脉栓塞模型的脑梗死体积，防止神经功能缺损的恶化，减轻白质损伤。此外，笔者还发现Gap19的神经保护作用明显强于Gap26，可能与Gap26和Gap27不仅抑制Cx43半通道，也抑制Cx43缝隙连接通道有关［45-46］。

为了使模拟肽能够通过血脑屏障进入大脑发挥作用，有研究人员对Cx43模拟肽进行了修饰。例如，在小鼠腹腔注射Gap19-TAT-生物素（7.5 μmol/kg）10 min后，在血管周围基底层检测到Gap19-TAT-生物素；80 min后，Gap19-TAT-生物素存在于GFAP阳性的星形胶质细胞中，并与Cx43共定位。在大脑中动脉永久闭塞后2 h，腹腔注射0.75 μmol/kg或7.5 μmol/kg Gap19-TAT分别显著缩小大脑梗死体积［42］。

5 结语与展望

缝隙连接蛋白的功能异常与多种疾病发生、发展密切相关，已是生命科学领域的研究热点［1，47-49］。缝隙连接蛋白家族成员各自有独有的特征，主要归因于它们CT的差异。Cx43 CT是所有连接蛋白中研究最广泛的一个结构域，Cx43 CT结构域的研究对于深入探索其它20种人类细胞缝隙连接蛋白CT的功能，将提供更多的线索和借鉴。Cx43 CT的磷酸化影响了Cx43的转运、GJ的组装和降解、GJ通道的门控，可作为细胞间缝隙连接开放或关闭的标志，在脑缺血的发生和发展过程中发挥重要的作用。虽然Cx43及Cx43 CT的磷酸化在脑缺血中的具体作用机制还有待明确，但是Cx43作为细胞间最重要的通讯方式之一，当其表达变化出现异常时，势必会影响神经细胞应对环境的刺激或改变。因此，进一步了解Cx43半通道及其所形成缝隙连接通道，将有助于探讨Cx43连接蛋白家族在疾病中的作用机理，为脑缺血及相关中枢神经系统疾病提供方向和治疗策略。