华重楼野生种群表型变异研究

周新华，曾平生，武晓玉，黄宇涛

(中国林业科学研究院 亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600)

种群内的遗传多样性是种质资源保存的依据。遗传多样性是指种群内基因和基因型的多样性，它体现了物种基因的丰富程度，是研究生态系统多样性和物种多样性的基础[1-5]。遗传多样性研究通常包括表型、生化、染色体、DNA和碱基序列等多层次遗传变异研究[6]。尽管表型性状不能完全等同于基因位点，但利用表型性状研究种群的遗传多样性具有简便、高效、经济、直观和实用等优点[7-12]。目前，国内外学者利用表型变异已在许多珍稀濒危植物上开展了研究[13-15]，为保护或遗传改良珍稀濒危植物资源奠定了理论基础。

华重楼ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara属百合科重楼属的多年生草本植物，作为重楼药材的基源植物收载于2020年版《中华人民共和国药典》中，是著名中成药云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药等的主要成分，具有非常高的药用和经济价值[16-19]。华重楼主要分布在我国江苏、浙江、江西、福建、广东、广西、湖北、湖南和四川等南方省份，自然生长于海拔600～1 350 m的林下荫处或沟谷边的草丛中[20]。华重楼作为一种珍贵的中药材，主要以根茎入药，药用活性成分为重楼皂苷，具有抗癌、止血、消炎、镇痛、止咳平喘和免疫调节等作用，常用于治疗蛇毒、乳腺炎、跌打损伤等病症[21-22]。虽然华重楼具有很高的药用和经济价值，在长江以南省份也偶见人工栽培，但研究主要集中在组培技术[23-24]、人工栽培[25]和药用成分分析[26-27]等方面，而遗传育种的基础性工作地理种群遗传变异少见有相关报道。本文以华重楼7个地理种群为研究对象，系统测定叶片、茎、花萼、果球和种子等的17个表型性状，运用统计学分析方法，深入研究种群间和种群内的变异规律，以期为华重楼种质资源保护、药材资源开发利用和繁育改良提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 样品来源与数据的收集

通过查阅中国植物数字标本馆(http://www.cvh.ac.cn/)和电子版《中国植物志》(http://www.iplant.cn/frps)初步确定华重楼的分布区域后，进一步通过文献检索、咨询当地相关专家和野外实地调查，最终确定华重楼的自然地理分布地，并于2018和2019年的9—11月间进行野生华重楼植株、叶片、花萼、果球和种子的样品采集和数据调查、测量工作。野生华重楼的样品数据采集点分别位于江西省新余市(JXXY)、浙江省丽水市(ZJLS)、四川省雅安市(SCYA)、广东省清远市(GDQY)、福建省三明市(FJSM)、湖南省娄底市(HNLD)和湖北省宜昌市(HBYC)，共计7个地理种群。数据采集时，选择生长情况正常、无明显的病虫害发生、无明显的生长畸形、达到生殖成熟、有正常饱满的果球的单株样品进行调查测量。鉴于华重楼天然种质资源分布稀少，调查时各地理种群单株保有量只需达到30株以上、样品单株间隔10 m即可。因野生华重楼多分布于深山沟壑，数据收集工作比较困难，故在选择样品单株时，各地理种群只调查15株，7个地理种群共计105株。调查测量时，现场记录样点的地理经纬度数据、海拔高度数据，其他气候因子数据通过查询资源学科领域基础科学数据整合与集成应用人地系统主题数据库(http://www.data.ac.cn)获得，具体数据见表1。

表 1 7个野生华重楼地理种群的地理及主要气候因子情况Table 1 Sample collection information of Paris polyphylla var.chinensis from different distribution regions and climatic data at the sampling sites

1.2 表型性状的测定

统计待调查表型性状的野生华重楼单株的叶片数和花萼片数，摘取其所有叶片和花萼片，平铺在硬纸板上，并利用数显游标卡尺测量其叶长、花萼长、叶宽、花萼宽，同时测量地径、果球横径和果球纵径等指标，精确到0.01 mm，测量结束后，计算叶片长宽比、花萼长宽比和果球横纵比；利用便携式叶面积测定仪(LI-3000C，LI-COR，Lincoln，USA)测定所有叶面积和花萼面积，精确到0.01 cm2；利用不锈钢卷尺测量每株野生华重楼的株高和花梗长，精确到0.1 cm；采集成熟种子，人工搓掉红色种皮，用清水冲洗干净，置于通风阴凉处，晾干后及时利用电子分析天平测定每个种群种子的千粒质量，精确到0.01 g。以上数据测量，每个种群选取5个样品单株，重复3次，每个种群测量15株，共计105株。

1.3 数据处理

利用社会统计学分析软件SPSS25.0对数据进行处理分析。应用表型分化系数、单因素方差分析以及多因素方差分析方法分析种群间和种群内的变异情况；利用相关分析来探讨表型因子与地理因子的关系。

2 结果与分析

2.1 野生华重楼种群间和种群内的表型变异

野生华重楼种群间和种群内的表型性状变异的方差分析结果见表2。所选取的17个表型性状除叶片数和花萼片数外，其余15个表型性状指标在种群间和种群内都存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的差异，这说明野生华重楼绝大多数表型性状在种群间和种群内存在广泛的变异。

野生华重楼7个地理种群17个表型性状的平均值、标准差及多重比较分析结果见表3。结果显示，除叶片数和花萼片数在各种群间差异不显著外，其余15个表型性状指标在各种群间均存在显著差异。其中，四川雅安种群的叶长、花萼长、叶宽、花萼宽、叶面积、花萼面积、株高和地径8个表型性状指标数值最大，与其他6个地理种群大多为差异显著；浙江丽水种群的果球纵径最大，叶片长宽比和果球横纵比最小；广东清远种群的花梗长、叶片长宽比和花萼长宽比最大，果球纵径最小；湖北宜昌种群的花梗长、叶长、花萼长、花萼宽、花萼长宽比、叶面积、种子千粒质量和地径8个表型性状指标为所有种群中最小，果球横纵比最大；湖南娄底种群果球横径和种子千粒质量最大；福建三明种群的果球横径最小，显著小于湖南娄底和浙江丽水种群。

表 2 野生华重楼种群间和种群内全株、果、叶及种子表型性状的方差分析结果1)Table 2 Variance analysis of phenptypic traits of wholeplant, leaf, fruit and seeds among and within Paris polyphylla var.chinensis

表 3 野生华重楼7个地理种群20个表型性状的平均值、标准差及多重比较1)Table 3 Mean, standard deviation and multiple comparison of 20 phenotypic traits in seven geographical populations of Paris polyphylla var.chinensis

续表 3 Continued table 3

野生华重楼7个地理种群的17个表型性状的方差分量及其种群间表型分化系数见表4。17个表型性状的平均方差分量在种群间占比26.39%、种群内占比52.19%、随机误差占比21.42%，就平均方差分量所占百分比而言，种群间只是种群内的一半，这说明野生华重楼生长表型在种群间的变异远小于种群内的变异；17个表型性状的平均分化系数种群间的贡献值为34.27% (即种群内的贡献值为65.73%)，这就进一步表明，野生华重楼的表型变异主要源于种群内部。

2.2 野生华重楼表型变异特征分析

野生华重楼各地理种群表型性状的变异系数列于表5。野生华重楼17个表型性状在种群内的平均变异系数为17.72%，变异幅度为6.83%～29.95%。花梗长、叶面积、花萼面积和株高4个表型性状指标的平均变异系数均大于20%，超过所有表型性状指标的平均变异系数(17.72%)；叶片数、花萼片数、果球横径、果球纵径、果球横纵比和种子千粒质量6个表型性状指标的平均变异系数均小于14.47%，小于所有表型性状指标的平均变异系数(17.72%)，表明华重楼叶片数量、花萼数量、果球和种子的性状稳定性大于其他性状指标的稳定性。进一步比较7个地理种群野生华重楼17个表型性状指标的平均变异系数可以得到，广东清远、湖南娄底和江西新余3个地理种群的变异系数均超过平均变异系数，表明广东清远、湖南娄底和江西新余野生华重楼种群的表型变异和多样性较为丰富；湖北宜昌、浙江丽水、四川雅安和福建三明4个地理种群的变异系数均小于平均变异系数，说明湖北宜昌、浙江丽水、四川雅安和福建三明地理种群的表型变异和多样性较广东清远、湖南娄底和江西新余地理种源弱。

2.3 野生华重楼种群表型的地理变异分析

对野生华重楼全株、茎、叶、花、果球和种子17个表型性状与样品采集点地理气象因子之间的相关性进行了分析，结果表明，叶长、叶宽和叶面积与样品采集点的经度呈现显著或极显著的负相关关系，说明随着经度的不断增加，野生华重楼叶长、叶宽和叶面积将不断减小；叶宽、叶面积、花萼长、花萼宽、花萼面积和果球纵径与纬度呈现显著或极显著的正相关关系，叶片长宽比和果球横纵比与纬度呈现极显著的负相关关系，这就说明随着纬度的增加，叶宽、叶面积、花萼长、花萼宽、花萼面积、果球纵径将呈现上升趋势，而叶片长宽比、果球横纵比将呈现下降趋势；叶长、叶宽、叶面积、花萼长、花萼宽、花萼面积、花萼长宽比、株高和地径与海拔呈现显著或极显著的正相关关系，果球横纵比和种子千粒质量与海拔呈现极显著的负相关关系，说明海拔越高，叶片、花萼、株高、地径也随之越大，果球横纵比和种子越小(表6)；叶宽、叶面积、花萼长、花萼面积、果球横径和果球纵径与年平均温度呈显著或极显著的负相关关系，叶片长宽比、花萼宽与年平均温度呈极显著的正相关关系，说明随着年平均温度的升高，叶片将变得小而长，种球也随之变小；叶长、叶宽、叶面积、花萼长、花萼宽、花萼面积和果球纵径与无霜期呈显著或极显著的正相关关系，果球横纵比则与无霜期呈现极显著的负相关关系，说明无霜期越长，叶片和花萼越大，果球越大；叶长、叶面积、花萼长、花萼宽、花萼面积与年日照时数呈显著或极显著负相关关系，说明日照时间越长，叶片和萼片越小；叶长、花萼长、花萼宽、果球纵径和种子千粒质量与年降水量呈显著或极显著正相关，果球横纵比则与年降水量呈极显著负相关，这说明年降水量越大，叶片越长，种子越大(表6)。对表6的综合分析发现，野生华重楼的叶片数、花萼片数和花梗长与7个生态地理环境因子无显著相关关系，说明这些生态地理环境因子对野生华重楼这一物种的种群形态影响不大。

表 4 野生华重楼表型性状的方差分量及种群间表型分化系数Table 4 Variance component and differentiation coefficients of phenotypic traits among and within populations in Paris polyphylla var.chinensis

表 5 野生华重楼种群17个表型性状变异系数Table 5 Variation coefficients of 17 phenotypic traits in Paris polyphylla var.chinensis populations %

续表 5 Continued table 5

表 6 野生华重楼17个表型性状与生态地理因子的相关系数1)Table 6 Correlation coefficients between 17 phenotypic traits of Paris polyphylla var.chinensis and ecological geography factors

3 讨论与结论

3.1 野生华重楼表型性状的变异来源

通过对野生华重楼7个地理种群的17个性状和生长表型指标的深入研究发现，无论是在种群间还是在种群内，除叶片数和花萼片数外的其他指标均存在显著或极显著的变异，这与多花黄精Polygonatumcyrtonema[2,28]、人参Panaxginseng[29]、毕节小檗Berberisguizhouensis[30]、八角莲Dysosma versipellis[31]等林下经济植物的研究结果类似。通过种群间的表型分化系数分析可知，种群间的变异远小于种群内的变异，这就说明种群内的变异是野生华重楼表型变异的主要来源。华重楼17个表型性状的变异幅度为16.38%～50.08%，平均表型分化系数为34.27%，种群间的变异仅贡献34.27%，远小于种群内的变异贡献65.73%，这一现象出现的可能原因：一是各种群的自然分布有着极强的区域性，这就增加了不同种群间的基因交流难度；二是野生华重楼的生长发育与林下小生境关系密切。综上所述，野生华重楼种群间的基因交流机会要小于种群内部的基因交流，说明华重楼的表型变异主要源自于各地理种群内部。

3.2 不同地理种群野生华重楼表型变异丰富度

变异系数在统计学中又称离散系数，是衡量离散程度的一个归一化量度指标，离散系数越大，则说明观测对象的变异越大，则对应的种群表型变异和多样性越丰富。通过对野生华重楼各地理种源表型指标的变异系数分析发现，所有指标的变异系数幅度在6.83%～29.95%之间，平均变异系数为17.72%，变异系数的变化幅度较大，种群内部的表型变异程度高，说明华重楼能够通过种群内部的遗传变异，更好地适应环境。

野生华重楼叶面积、花萼面积、株高、地径、果球横径、果球纵径、果球横纵比和种子千粒质量8个表型指标的变异系数分别为27.72%、29.95%、29.89%、15.16%、12.57%、14.34%、10.19% 和6.83%，前3个指标远大于平均变异系数，后5个指标远小于平均变异系数，这些指标的稳定性排名依次为种子千粒质量>果球横纵比>果球横径>果球纵径>地径>叶面积>株高>花萼面积，说明野生华重楼种子的稳定性最高，果球的稳定性其次，茎的稳定性排第3，叶片和花萼的稳定性最差，这与多花黄精Polygonatumcyrtonema这方面性状的研究结果[2]是类似的。

3.3 野生华重楼表型性状的地理变异规律性

本研究发现，所选取的野生华重楼17个表型性状指标中，除叶片数、花萼片数和花梗长3个表型性状指标与所有地理气象因子无显著相关性外，其余性状指标均与部分地理气象因子存在显著或极显著的相关性，这说明地理气象因子对野生华重楼的种群表型影响较大。经度的增加会抑制叶长、叶宽和叶面积的生长，纬度的增加会促进叶片和果球的生长；海拔与野生华重楼的叶、茎营养生长呈现正相关关系，与果球和种子的生殖生长呈现负相关关系，说明海拔增加会促进营养生长，抑制生殖生长；年均温度、无霜期、年日照时长和年降雨量等环境因子均与绝大多数表型指标存在显著或极显著相关性，说明其表型变异受多个环境因子的共同控制。

3.4 野生华重楼保护策略

华重楼是重楼药材的法定基原，是许多知名中成药不可或缺的主要组分材料，随着制药工业的不断发展，人们对华重楼的需求越来越大。因华重楼人工栽培种植周期长、生境要求苛刻、种植技术难，人们为了满足需求对其进行掠夺性、毁灭性的采挖，导致野生资源枯竭，处于濒危状态。

因此，开展野生华重楼资源保护的研究是非常有必要的，笔者结合研究结果，提出以下保护策略：首先，建议将遗传变异多样性丰富的华重楼地理种群原生地−广东清远设定为重点育种保护地；其次，严禁破坏野生华重楼的原生环境，为华重楼种群的恢复提供生境支撑；第三，及时开展华重楼人工繁育研究，争取在短时间内解决种苗繁育问题，为市场提供充足的人工种苗；最后，收集全分布区华重楼种质资源，建立保存圃，做好基因资源的抢救性保存工作。