生命早期应激下肝调畅情志功能中枢改变探讨＊

史亚飞，张 荣，曹可润，郭丽丽，董钊扬

（1.广州中医药大学基础医学院 广州 510006；2.广州中医药大学中药学院 广州 510006；3.河南中医药大学第三临床医学院 郑州 450000；4.广州中医药大学护理学院 广州 510006）

精神情志异常类疾病给现代社会带来越来越沉重的负担，从中医肝主疏泄调畅情志功能入手可以对此类疾病给予很好的防治，并揭示其内在的发病机制。但随着研究的不断深入，各项结果均显示其症状的严重程度、预后等，除了跟生物致病因素有关外，更与众多社会因素密切相关[1]。生命早期应激为肝主疏泄调畅情志功能研究及其对精神情志异常类疾病的防治提供了更全面的视角。情志功能改变不仅是即刻应激因素所导致的效应，也与早期应激负性因素与事件紧密相关[2]。这在现代社会 “亲子长期分离、人际缺乏必要交流、长期负性压力” 不良生活方式下所致的青少年认知障碍、社交障碍、情志异常等病证中尤为突出。更重要的是，早期应激的前期效应与成年后应激诱导的叠加可能是情志疾病发作与反复的重要原因。将两者结合研究更加符合其生理病理发展过程，有助于进一步阐明发病机制。

基于 “方-证（模型）-效-功能本质” 思路，从正常应激下的生理变化和病证状态下的病理改变两条途径入手，肝调畅情志中枢功能研究已取得较为一致的初步结果[3-5]。在此基础上，本课题组立足早期应激这一重要因素，结合中医生命早期 “肝常有余” 生理特性开展探索性研究[6]，助力肝调畅情志功能中枢机制研究的深入。现试探讨之。

1 新的研究切入点

1.1 聚焦多因素病因

研究重点关注早期应激效应及其与成年后应激的相互作用。目前对情志异常病因较为一致的现代认识是遗传因素、生命早期负性应激及成年后的环境因素的相互作用[7]。早期应激是指在生命早期如母孕期、儿童期、青少期等受到的超出自身承受能力的生理心理创伤[8]。伴随现代生活方式的转变，早期应激已成为情志发病的重要因素。主要是基于：生命早期是神经元生长及突触形成的关键阶段，广泛涉及中枢神经突触重塑。除本身的负性作用外，早期应激还会对大脑发育、行为、学习记忆形成过程产生长期的影响，神经生长重塑改变，进而诱导成年后的情志与认知障碍[9,10]。从中医病机来看，生命早期 “神” “形” 同步发展，是人体脏腑功能与心身发育的关键时期，易受外界侵扰，并迁延或影响至成年。特别青少期是向成年期过渡的重要时期，生理变化大，社会接触多，或家长过度溺爱、或缺乏关爱，所欲不遂，极易发生情志改变，并影响至成年[11]。因此，生命早期不良情志改变及其对成年后的影响应该成为肝调畅情志功能研究的重要内容。

1.2 强化证候状态模拟

生命早期 “肝常有余” 生理特性有助于情志内伤肝病证过程构建。从五脏功能而言，小儿多 “肺气娇嫩，脾常不足，肾常虚，心常用余、肝常用余” 。特别是青少期， “肝常有余” 指机体秉少阳生发之气，如草木初萌，生机蓬勃，发育迅速；肝气升发则五脏俱荣，肝失升发则五脏虚衰；病理上 “小儿易怒，肝病最多” ，受外界刺激，肝喜条达之性被扼，出现郁怒、烦躁、抑郁等表现，生理上的有余转化为病理上的亢盛。因此，肝调畅情志在青少年心身发育中发挥着重要作用[12]。从现代研究来看，随着医学模式转变，与躯体性疾病相比，青少期心理情志异常呈大幅上升趋势，且青少期情志异常90%以上多是多种心理行为疾病共病[13]，郁怒、烦躁、焦虑、抑郁等交杂出现，提示生命早期（青少期）情志内伤病理状态是多证候共同存在的状态。此状态可以更加体现出长期情志内伤所致的肝失疏泄病证过程中交杂存在的 “肝气郁结” “肝火上炎” “肝阳上亢” 等多证候状态，体现慢性应激状态下情志内伤肝病证的综合改变过程，有助于基础实验研究的开展。基于生理发展和病证改变多个角度，从生命早期（青少期）慢性应激反应入手，有助于肝失疏泄证候变化的研究和青少期情志异常证治机理的阐明。

1.3 重视病证动态观测

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）系统可作为关键脑区同一通路的持续观测靶点。动态观测变化是科学评价中医病证的必由之路径，也是当前脑中枢机制研究的发展趋势。由于生长发育过程中神经内分泌系统的不稳定变化，动态观测中枢调控关键脑区变化，同步开展早期应激及其与成年后诱导相结合的累积效应分析成为难点，必须寻求一个稳定的作用通路。5-HT系统或可成为这一目标的最佳靶点或生物学标记物。其一，在神经元生长及突触形成的青少期阶段，5-HT系统即已达到成熟且稳定维持至成年，可以为青少期及成年后两个时期比较性研究提供同一通路靶点（其他通路仍多处于变化当中）[14,15]。其二，5-HT系统一直是调肝治法方药干预情志异常疾病的较为肯定的主要通路之一，结合现有早期应激相关研究提示：①5-HT系统在早期应激作用下可能在青少期即已改变，并影响至成年；②青少期应激效应及其诱发的抑郁等主要由5-HT系统介导，调肝治法方药（四逆散及其加味）可以有效进行调控[16，17，18]。从青少期和成年期两阶段、多时间节点入手，以5-HT及其相关信号传导通路改变为主要观测指标，为动态观测肝调畅情志病证中枢变化提供了新思路。

2 初步的一些研究结果

综上所述，病因上从生命早期慢性应激因素入手，病机病理上充分结合生命早期（青少期） “肝常有余” 生理特性，以5-HT及其相关信号传导通路改变为主要观测指标，动态观测肝调畅情志中枢调控关键脑区变化，分析生命早期应激因素及其与成年后环境应激诱导相结合的协同与累积效应，应成为肝调畅情志功能中枢机制研究的新领域。开展相应的实验研究有助于该论点论据的证实。

2.1 假说的提出

生命早期应激是导致肝调畅情志功能变化的重要病因，情志内伤肝失疏泄病证过程又在生命早期应激状态下得到更好地体现。基于两者的紧密关联性，病证结合开展生命早期应激反应状态下的肝失疏泄情志失调功能机制研究是一个新的较好途径。针对生命早期神经元生长及突触形成特点，结合5-HT系统早成熟、早稳定性，早期（特别是青少期）应激状态下5-HT系统改变可作为观测肝主疏泄调畅情志功能变化的核心靶点与通路，其所在核团中缝背核的功能改变、5-HT突触可塑性改变、及5-HT的异常释放可能是肝失疏泄及其病证（抑郁等）中枢改变的重要病理生理基础。中缝背核突触前膜5-羟色胺转运体（5-hydroxytryptamine transporter，5-HTT）重摄取、5-HT1AR的负反馈及钙敏感受体（Calcium-sensing receptor，CaSR）等介导的信号通路，可作为核心观测指标和调肝治法方药作用机制研究的关键靶点。同时，为观测生命早期应激因素与成年后应激的协同与累积效应，动态检测应激状态下不同时段的5-HT系统变化，亦是必须开展的重要研究工作。

动物模型复制上，采用母婴（子）分离模型（Maternal separation，MS）和慢性不可预知（计）性心理应激模型（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）模拟生命早期应激负性事件对青少期及成年后情志异常发病的影响。CUMS是主要模拟慢性抑郁状态的经典模型，通过倾斜笼具、潮湿垫料、合笼、热水游泳等温和刺激因子造模。母婴（子）分离模型是探讨早期负性应激事件相关的子代及其成年后精神障碍与心身疾病发病机制的经典模型，通过剥夺模拟新生子代动物的早期生活环境来观察其行为及神经发生发育改变[19]。

2.2 初步的实验发现

2.2.1 模型复制与评价

青少年期在人类生命周期中为13岁-18岁，对于大鼠来讲大致为出生后28天-60天[20]。单纯采用CUMS制作青少期（32天-60天）应激动物模型，结果表明60天青少期大鼠应激造模后体重增长缓慢，糖水偏爱指数显著降低，促肾上腺皮质激素（Adrenocortico-tropic-hormone，ACTH）和皮质酮（Corticosterone，CORT）含量显著升高，对照CUMS行为学及激素水平等指标的基本变化，提示青少年期应激模型制备成功。旷场测试是检测大鼠抑郁焦虑行为的经典指标之一。结果显示模型大鼠中央区活动时间有所延长，提示应激后模型大鼠对新环境的认知能力相对较差[18]。

本课题组对首次运用的母婴分离应激模型大鼠行为学等进行了系统观察。实验采用1日龄SD大鼠，随机设置母婴分离（MS）组和空白组，雌雄各半。分别于56天、58天、60天、67天、74天进行旷场、糖水偏爱、高架Zero迷宫、强迫游泳等行为学实验检测。结果显示，经历哺乳期（1天-21天）MS应激雄性大鼠22天-52天的体重增长量显著低于正常饲养的大鼠，雌性组有增长变缓趋势但无统计学差异。在行为学的评估中，研究采取较为经典的快感缺失和行为绝望评价指标。结果显示，雌雄模型大鼠的糖水偏爱度均显著降低。强迫游泳实验中，雄性MS大鼠的漂浮不动时间高于正常大鼠。旷场实验结果显示，在雌性大鼠中不具有统计学意义，而雄性MS大鼠的活跃度显著低于正常大鼠。高架Zero迷宫检测中，雄性模型大鼠进入开臂的次数百分比明显低于空白组，雌性模型大鼠百分比均明显低于空白组。各项数据显示：经历21天母婴分离应激的雌雄大鼠，在青少期均出现了抑郁样行为，并伴随一定程度的焦虑样行为[21]。

在早期应激及其与成年后应激诱导相互作用的复合模型实验中采取了多种方式。一是儿童期青少期内复合应激，如在儿童期（1天-21天）母子分离后再进行青少期（24天-51天）CUMS造模，观察51天青少期应激大鼠状态[22]；二是青少期与成年期应激的联合采用，如在青少期（21天-44天）与成年期（57天-78天）分段运用CUMS制备方式，并选择44天、56天、78天三个时间点作为青少年期、成年期、成年后三个年龄阶段的观察点[23]；或在儿童期（1天-21天）母子分离后再进行成年期（60天-100天）CUMS造模，观察100天成年期应激大鼠状态，来模拟不同情况下的青少期和成年期复合应激抑郁大鼠状态[24]。以上模型在体重增长、糖水偏爱指数、行为学等方面亦显示出相似结果。

2.2.2 调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质（Hypothalamuspituitary-adrenal，HPA）轴

HPA轴改变是慢性心理应激反应神经内分泌系统的基本改变。60天时青少期应激模型大鼠血浆ACTH和CORT含量均明显上升，表明慢性应激状态下的青少期大鼠HPA轴处于亢进状态；经过治疗后的模型大鼠血浆ACTH和血清CORT含量均明显下降，提示调肝经典方药（四逆散及其加味）可以显著改善模型大鼠的应激状态[18]。在母子分离（1天-21天）和CUMS（24天-51天）青少期复合应激抑郁大鼠模型中，显示出相似结果[22]。

2.2.3 对中枢单胺类神经递质的影响

海马和前额叶皮质是调节情绪的重要脑区。研究显示，56天应激大鼠海马及前额叶皮质中单胺类神经递质去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）、多巴胺（Dopamine，DA）、5-HT含量均显著下降，提示CUMS青少期应激大鼠抑郁样行为与相关脑区的单胺类神经递质表达降低有关[16]。在母婴分离（21天-28天）和CUMS（29天-56天）复合应激模型中，大鼠脑中枢海马及前额叶皮质部位5-HT及5-羟吲哚乙酸含量均较母婴分离模型大鼠进一步降低，雌性大鼠和雄性大鼠之间无统计学差异，提示经母婴分离后，再次受到青少期慢性二次应激会加重中枢海马及前额叶部位的神经元功能损伤，从而加重抑郁样行为；未发现性别之间有差异。加味四逆散组大鼠可提高大鼠海马和前额叶皮质中单胺类神经递质的表达[25]。

2.2.4 对中枢5-HT通路的影响及不同阶段的动态观察

采取CUMS模型，青少期（21天-44天）与成年期（57天-78天）造模及给药，选择44天、56天、78天3个时间点作为青少年期、成年期、成年后三个年龄阶段的动态观察点。结果显示：青少期模型大鼠海马CA1区神经元细胞排列松散，镜下较多神经元萎缩；成年期与成年后组镜下则可见较多神经元萎缩，局部区域神经元缺失且小胶质细胞增生，提示CUMS应激可引起中枢海马的结构及功能呈进行性损伤。与同阶段模型组相比，加味四逆散治疗组神经元萎缩与深染减少，提示调肝方药有一定干预作用[23]。

5-HTT、5-HT1A受 体（Serotonin 1A receptor，5-HT1AR）是反映5-HT能神经元功能活动的重要指标。结果表明，按照生命成长时间顺序，青少年期、成年期、成年后各组空白组大鼠中枢海马CA1区5-HTT平均光密度值呈上升趋势，而造模后成年期、成年后显著降低；与模型组对比，加味四逆散组结果有升高趋势。各组大鼠海马CA1区5-HT1AR平均光密度值组内比较，青少期与成年后组模型组有显著降低；加味四逆散组有上升趋势。提示，CUMS导致青少期大鼠产生抑郁样行为，在成年后阶段继续施加负性不可预计性刺激会将会进一步加重抑郁状态，海马内5-HTT、5-HT1AR改变可能是重要通路。复合模型中于幼年期组（28天）、青少期组（42天）、成年期组（56天）取材，免疫组化实验检测原位5-HT1AR表达，检测各组大鼠中枢海马的5-HT1AR、环磷腺苷效应元件结合蛋白（Cyclic adenosine effector element-binding protein，CREB）、磷酸化cAMP依赖蛋白激酶（Phosphorylated protein kinase A，p-PKA）底物蛋白和脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）蛋白表达，结果显示早期经历母婴分离应激的大鼠海马内5-HT1AR/CREB/BDNF信号通路蛋白分别在幼年期、青少期和成年期表现出不同程度的下调[26]。

2.2.5 四逆散及其加味的干预作用

以方测证，回归经典，采用临床上用于情志疾病治疗的常用基础方——四逆散（柴胡、芍药、枳实、甘草）以及加味方。其中，柴胡疏肝解郁，顺应肝升发条达之性；枳实助柴胡疏肝行气理脾；白芍清热滋阴养血柔肝，兼防肝郁化火；甘草，调和诸药。整个方剂组成根据青少期应激反应过程的实际病理变化， “解郁” 为主，疏肝、柔肝、平肝及清肝有机并用。在上述系列实验中，以四逆散及其加味为代表方剂的调肝治法方药可以有效干预MS、CUMS及其复合应激大鼠模型的抑郁样行为与症状。作用通路与上调5-HT1AR/CREB/BDNF信号等多个通路有关。而且对复方辨证治疗抑郁症的高频中药数据研究表明，柴胡、白芍、甘草均是治疗抑郁症的高频药物[27]。

2.3 一些初步的结论

2.3.1 成功模拟生命早期应激及复合应激下的肝失疏泄情志内伤状态

生命早期应激是导致青少期情志异常的重要因素，并对成年后情志异常的发生与反复产生重要影响。早期应激状态下情志内伤肝失疏泄病证得到更好体现。 “四逆散-生命早期应激（母子分离）模型-5-HT能系统-中缝背核脑区-肝调畅情志功能” 这一方-证（模型）-效-功能本质研究思路得到确立。

2.3.2 初步阐明早期应激状态下情志内伤肝失疏泄病证改变，丰富并完善四逆散抗抑郁药效研究。

早期应激下肝调畅情志功能中枢改变与各部位（中缝背核、海马和前额叶皮质）单胺类神经递质相关，尤以5-HT、5-HT1AR含量改变密切。不同剂量四逆散及其加味对模型大鼠产生作用，显示调肝方药可以显著改善生命早期（青少期）应激大鼠的抑郁样表现，可能通过上调海马5-HT1AR-CREB-BDNF信号通路发挥抗抑郁作用，并与中缝背核5-HT1AR、5-HTT、CaSR、BDNF等蛋白表达有关。

3 未来研究的思考

3.1 病因与病理阶段的拓展

生命早期包括母孕期、儿童期、青少期等各阶段，事实上各阶段之间存在着密切的联系与影响。近年来许多中医药学者开展的研究均涉及到以上各个阶段[28，29，30]。特别是魏盛等提出 “七情伏邪学说” 是在理论上对青少期负性事件对后期情志异常发病机制影响的一个创新[30]。结果证实，母孕期刺激后，父代与子代之间的影响，子代中儿童期、青少期以及对成年期之间的影响，都是非常有价值的研究命题。应当继续研究下去。

3.2 进一步推进青少期与成年期抑郁之间的比较性研究

两者在神经内分泌免疫系统改变和药物干预效果等方面既存在不同，但也有重要的联系与协同作用。生命早期应激病因方式可成为不同年龄阶段之间的重要研究通道。必须关注生命早期应激因素在精神障碍类或情志异常疾病机制研究中的重要作用，并运用其作为动态观察肝失疏泄情志失调病证变化的载体。中缝背核5-HT能系统可成为两者比较性研究的效能观测指标。

3.3 尝试推动肝失疏泄情志失调病证变化的动态观测

整体审察、病证结合、辩证论治是中医诊治的核心内容，因此开展证候研究必然要进行动态观测变化。肝失疏泄情志失调病因病机具有明显的持续性与累积性，结合心理变化过程，必然使肝失疏泄病证是一个长期形成、动态变化与的过程。在前期大量的成年期情失内伤肝失疏泄病证变化研究结果上，将生命早期包括母孕期、儿童期、青少期等各阶段纳入，开展全过程研究，将使肝调畅情志功能与病证规律研究迈上新台阶。结合当前脑核团功能神经影像学研究的不断深入，肝调畅情志功能中枢改变亦会越来越明晰[31]。