改构乳酸链球菌素对奶牛乳房炎主要致病菌的抗菌活性研究

杨贵军 刘鼎阔 刘芳 李源 胡鹏程 林霖雨 管振国/天津市生物饲料添加剂企业重点实验室 300383

针对奶牛乳房炎这一疾病，国内外很多学者对其进行了深入研究，但目前这一疾病仍旧是导致奶牛养殖业造成严重经济损失的疾病之一。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等病原微生物是造成奶牛乳房炎最为主要的病原体。有学者发现，乳酸链球菌素对奶牛乳房炎具有显著的治疗效果。同时，有研究表明，乳酸链球菌素在一定条件下对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

1 试验目的

本试验旨在检测改构乳酸链球菌素在一定浓度范围内对奶牛乳房炎主要致病菌是否具有抗菌活性。

2 试验材料

2.1 菌株链球菌（Streptococcus）临床菌株L 1473、L 4732、L 2348、L 2853、L 1463 和L 5321 与大肠杆菌分离株来自同样的两个奶牛场的乳房炎患牛；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 1717 和ATCC 29213：购 自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）；临床菌株S 1963、S3210、S1689 和S2425 与链球菌、大肠杆菌分离株来自同样的两个奶牛场的乳房炎患牛。大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 43895 和ATCC 43890：购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）；临 床菌株EC3521、EC5632、EC3478 及EC2569大肠杆菌分离株：取自两个奶牛场的乳房炎患牛。

2.2 仪器UV～2600 型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯）；电子天平（深圳市恒志福科技有限公司）；8037～SVD 压力蒸汽灭菌锅（山东博科消毒设备有限公司）；THZ～82 恒温摇床（上海跃进）；微量移液器（德国艾本德）；超净工作台、生化培养箱（哈尔滨东联）；其它玻璃仪器（北京鼎国）。

2.3 药品和试剂供试品：改构乳酸链球菌素，由天津市生物饲料添加剂重点实验室提供。效价：2000IU，经检验合格。

MH 肉汤培养基（MHB）（BD Biosciences）；二甲基亚砜（DMSO）（sigma）。

2.4 试验所需试剂的配制

（1）药物配制：精确称取改构乳酸链球菌素，溶解于DMSO 中，配制成浓度为51200 μg/mL 的母液，备用。

（2）MHB 培养基：称取MHB 粉末21.0 g，加热溶解于1000mL 蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，备用。

3 试验方法

3.1 细菌培养取各受试菌的甘油保存液，以1∶100 接种到3～5mL 各自适宜的培养基中，置于37℃摇床中震荡培养18～24 h，再划线接种于琼脂平板上，置于37℃生化培养箱中培养过夜。挑取各平板上的单菌落，接种于液体培养基中，振荡培养至对数生长期，再次划线接种于琼脂平板上。生化培养箱中静置过夜后，用封口膜密封，置于4℃环境保存。再次挑取各平板上的单菌落，接种于MHB 培养基中，置于37℃摇床中振荡培养10～12 h 至对数生长期。应用紫外分光光度计测定OD600，用MHB 培养基调整细菌浓度至5×108CFUs/mL，待用。

3.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定取高压灭菌后的试管置于超净工作台中，12 支试管为一行。每行第一支试管中加入1975 μL MHB 培养基，其余试管均加入1mL 培养基。然后于第1 个试管中加入改构乳酸链球菌素储备液25 μL，混匀后依次进行倍比稀释（药物经稀释后DMSO 含量不超过1%），使得改构乳酸链球菌素的浓度依次为512、256、128……1 μg/mL 共10 个浓度梯度。同时设阳性对照。而最后一支为不加待测药物的阴性对照。每支试管中加入5 μL 稀释后的菌液，使得每支试管的菌液浓度为 5×105CFUs/ml。每组重复三次。将试管架置于生化培养箱中 37℃静置培养12～24 h 后观察，记录结果。以没有肉眼可见的细菌生长的最低药物浓度为评判标准。

3.3 最小杀菌浓度（MBC）的测定取高压灭菌后的试管置于超净工作台中，7 支试管为一行。每行第一支试管中加入浓度为16 MIC 改构乳酸链球菌素，充分混匀后，依次2 倍稀释至第五支试管。余下的试管一支为只加菌液的阴性对照，另一支为只有培养基的空白对照。加入5 μL 稀释后的菌液，使得每支试管的菌液浓度为 5×105CFUs/ml。每组重复三次。将试管架置于生化培养箱中 37℃静置培养12～24 h 后，分别用直径4 mm 的接种环取一环样液划线接种于各自适宜的固体培养基上，于37℃孵育48 小时。观察有无细菌生长，以无菌生长的最低浓度作为最小杀菌浓度。。

4 试验结果

4.1 改构乳酸链球菌素对奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌浓度（MIC）本实验采用试管二倍稀释法考察了改构乳酸链球菌素对引起奶牛乳房炎的三大主要病原菌的抗菌活性。结果，改构乳酸链球菌素对所测的6 株金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，其MIC 值在0.02～0.06 µg/mL 范围之内。试验结果说明，即使金葡菌对其他抗生素具有不同的敏感性，但是对耐药金葡菌（ATCC 1717）及不耐药金葡菌（ATCC 29213）对改构乳酸链球菌素的敏感性并未受此影响。并且，改构乳酸链球菌素对临床分离金葡菌的抑菌作用，与其对标准（耐药和不耐药）菌株的抑菌作用基本上在同一水平，均具有较强的抑菌性。本研究中改构乳酸链球菌素对6 株链球菌的抑菌作用与其对金葡菌的抑菌作用水平相似，MIC 值范围为0.04～0.06 µg/mL；改构乳酸链球菌素对本研究所测的6 株大肠杆菌的MIC 值范围为0.062～0.115 µg/mL。

4.2 改构乳酸链球菌素对奶牛乳房炎主要致病菌最小杀菌浓度（MBC）根据最小抑菌浓度，调整改构乳酸链球菌素受试浓度。结果表明，改构乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌所试菌株的MBC 基本在MIC～4MIC之间。三种菌株的MBC 依次分别为0.04～0.16 μg/mL、0.09～0.15 μg/mL 及0.15～0.32 μg/mL。若依据细菌对所试药物产生了耐药性的MBC 标准为MBC≥32 MIC，则本试验中18 株试验菌株对改构乳酸链球菌素均未产生耐药性。

5 结论

分析药敏试验结果发现，改构乳酸链球菌素对于金葡菌、链球菌和大肠杆菌的抑菌及杀菌作用较强。这一结果提示改构乳酸链球菌素是一种潜在的可开发为抗奶牛乳房炎感染的新药物。