杜仲叶黄酮类化合物的提取纯化及功能活性分析

王俊朋 ， 张立攀 ， 王春杰 ， 李 冰 ， 赵梦瑶 ， 关炳峰 ， 胡桂芳

(河南省商业科学研究所有限责任公司 ， 河南 郑州 450000)

杜仲是杜仲科植物，属于我国特有品种，是一种珍贵的中药材。杜仲在中国已有2 000多年的历史，我国的杜仲种植面积广泛，资源丰富。杜仲全身是宝，研究表明杜仲的种、皮、根、籽、叶等都具有很高的功能活性。杜仲皮和杜仲胶目前已经被广泛开发应用，而杜仲叶的利用率却很低。杜仲叶活性成分复杂，包括环烯醚萜类化合物、木脂素类化合物、黄酮类化合物、杜仲胶、苯丙素类化合物、酚类化合物、氨基酸、多糖类物质、维生素、脂肪酸，具有抗氧化、抗疲劳、降血脂等功效。中医很多古籍有载杜仲入肝、肾，有补中益气、坚筋骨、强志、安胎之功效。现代研究发现杜仲有降压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗癌、抑制细菌、抗病毒、抗真菌、增强免疫力、利尿、减肥作用，以及有利于骨骼健康的作用[1-5]。

然而，目前针对杜仲的资源开发应用比较狭隘，主要局限于杜仲皮和杜仲胶，杜仲自古以来将杜仲皮入药使用。杜仲胶作为一种天然高分子材料，和合成橡胶成分类似，常用于航空、航天、国防、化工等领域，因其具有独特的结构和性能。而资源更为丰富的杜仲叶却尚未被深度开发利用，因缺乏有效的加工方式，造成资源的浪费[6]。研究表明杜仲叶(Eucommia Folium)与杜仲皮活性功能成分和药理作用一致。目前已知的经过分离纯化并鉴定出来的杜仲有机化合物约有70种以上，矿物质达15种以上。杜仲属于可再生利用资源，主要分布于我国河南、陕西、甘肃、湖北等地，种植面积广泛，产量巨大。杜仲叶中含有丰富的活性成分，如黄酮、绿原酸等，近年来总黄酮的研究一直都备受关注。研究表明，杜仲不同部位的总黄酮含量差别很大，以老叶中总黄酮含量最高。如果能够对黄酮类化合物的药用价值进行充分开发利用，将杜仲的天然成分应用到各行业领域，那么对整个食品行业会具有积极的助推作用[7-9]。

本文对杜仲叶的化学成分、黄酮类化合物的提取方法、黄酮类化合物的分离纯化、功能活性研究等进行综述，期望对杜仲叶中黄酮类化合物的综合开发利用提供一定的理论依据。

1 杜仲化学成分分析

杜仲各部位的主要成分基本相似，经实验检测分析从杜仲皮、叶中分离得到的化学成分如下：木脂素及其苷类、环烯醚萜类成分、杜仲胶、甾萜类化合物、酚类化合物、脂肪酸、维生素、氨基酸及微量元素、黄酮类化合物等。其中黄酮类化合物主要包括槲皮素、莰菲醇、山奈酚、紫云英苷、陆地锦苷以及3-O-[β-D-吡喃葡糖-(1-2)-β-D-吡喃木糖]-槲皮素黄酮苷等[10]。

2 杜仲叶黄酮类化合物的提取

目前杜仲叶中总黄酮的提取方法主要有水提法、溶剂法、超声波提取法、微波提取法、超临界CO2萃取法、酶解法和半仿生提取法[11]。

2.1 水提法

水提法是利用水蒸气和被蒸馏组分不相容的原理，使被分离物质能在比原沸点低的情况下随着水蒸气一起逸出。将杜仲叶粉碎后，按一定的料液比浸入水中，在适宜的温度下浸提一定时间，从而得到含有杜仲叶有效成分的浸提液。水提法以水为溶剂，利用黄酮类化合物易溶于水的原理进行提取。水提法提取液黏度大，过滤浓缩困难，提取物容易发生霉变。张亦琳等[12]利用双水相分离纯化杜仲黄酮类化合物，经过条件优化得在50%的乙醇浓度，20%质量分数的KH2PO4情况下，杜仲叶总黄酮的萃取率达77.94%。何德飞等[13]利用水提法提取杜仲叶中总黄酮，发现料液比1∶16，萃取时间24 h，杜仲叶有效成分溶出最多。

2.2 溶剂法

溶剂法是一种传统的提取方法，根据原料中被提取成分的理化性质及极性特征，利用相似相容的原理将其中的有效成分从固体组织中转移到液体或气体中。杜仲叶中黄酮不仅易溶于水，通过水提方法分离，还易溶于乙醇、甲醇、乙醚等有机溶剂。刘军海等[14]用丙酮-水为溶剂提取杜仲叶中黄酮，在料液比1∶16，提取温度65 ℃，提取时间2 h时最佳，最佳提取率达1.86%，总黄酮含量10.96%。杜仲中的活性成分多数是溶于极性物质的，乙醇是使用最普遍的一种有机溶剂，但是由于提取过程杂质较多，对后期的纯化不利。赵文红[15]通过醇提杜仲叶中黄酮类化合物，得出最佳提取工艺参数为乙醇浓度50%，80 ℃下回流60 min，黄酮得率为3.18%。

2.3 超声提取法

超声提取法原理是利用超声波辐射产生的空化、震荡、乳化、扩散等多级效应，使物料的细胞壁加速破裂，增大穿透力，使溶剂进入细胞内，达到提取的目的。黄酮类化合物属于胞内物，传统的水提和醇提工艺提取率较低，因此需要破坏细胞壁才可以增加其溶出率。王柏强等[16]通过单因素和正交试验优化超声波辅助提取杜仲叶黄酮的工艺，分别选择纤维素酶用量为30 mg，料液比1 g∶30 mL，酶解pH值5.0，酶解温度45 ℃作为影响因素，然后在温度50 ℃下超声15 min。此工艺条件下，总黄酮提取率为3.08%。与传统提取方法比起来具有提取条件温和，溶剂用量少，有效成分提取率高，减少环境污染等优点。袁英髦等[17]通过超声辅助提取杜仲皮中的黄酮，发现超声频率控制在40 kHz时，随着功率的升高、时间的延长提取率呈增长趋势。超声辅助提取法振荡频率增加会加速有效成分在溶剂中的扩散和溶出，能够大幅度的缩短溶剂提取时间，降低提取温度，提高黄酮的提取率[18]。超声波还适用于对热敏感的成分提取。超声波提取法的特性有：①超声波在气液固三种介质中均可以有效的传播，应用范围广泛。②超声波通过传播高能量达到破坏细胞壁的目的。③超声波会产生一些反射、叠加和共振等现象，在传播介质中会产生冲击或空化，加速传播速度。

2.4 微波提取法

微波提取法的原理是利用微波辐射穿透溶剂到达细胞内，产生的磁场能加速被萃取成分快速从固体向固液界面转移，微波的振动频率和分子的振动频率相关联，迅速产生热能加速被提取物质分子的热运动，使细胞壁快速破坏，从而提高有效成分的溶出率和提取率。刘桂萍等[19]以杜仲叶粉为原料，通过单因素和正交实验确定微波辅助提取黄酮的工艺条件，当料液比1∶25，功率320 W，提取时间2.5 min时提取率可达8.7%。该方法作为一种新型提取工艺，其最大的特点就是能促使极性分子加速溶出，加热迅速、节能、环保、方便操作控制，能缩短提取时间，非常适合应用于杜仲叶黄酮工业化提取，但是该方法不适用于非极性物质的提取。

2.5 超临界CO2萃取法

传统的溶剂法具有高提取率的优点，但是也有需要回收溶剂的缺点，而且对提取温度要求比较高。超临界CO2利用是指处于超临界状态的CO2作为溶剂应用于对物料进行分离提取的一种技术，优点是萃取时间短、节能费用、环保。超临界萃取是通过温度和压力调节控制其溶解性的。王华芳等[20]以杜仲叶为原料，通过研究超临界CO2萃取黄酮的工艺条件得到萃取温度50 ℃，萃取压力30 MPa，萃取时间120 min时，提取率达10.55%。

此方法具有诸多优点：①萃取速度高于液体萃取，比较适合提取固体物料中的有效成分。②能耗低，适合应用于热敏性、易氧化物质的提取。③温度容易控制，热量传播速度快。④针对一些易挥发性成分也能达到分离的目的[21]。

2.6 酶解法

中草药成分复杂，包括蛋白质、果胶、植物纤维等多种非必需成分，植物细胞壁和这些成分会阻碍一些被提取有效成分的溶出，利用酶反应去除一些特定结构可用于提高有效成分的释放速度。酶解法提取是通过合适的酶来处理杜仲叶，使组成杜仲叶细胞的纤维素、果胶等成分遭到破坏，从而提高胞内有效成分的溶出速率。陈晓娟等[22]通过酶法提取杜仲叶中黄酮，分别考察果胶酶用量、酶解时间、料液比、pH值等因素，并通过正交试验得出最佳工艺参数，在果胶酶用量1.5 mL，80 ℃下酶解2 h时，黄酮得率为0.043%。酶解法提取具有专一性强、反应条件温和、提取效率高、节能等特点，能够使有效成分快速溶解，在成分复杂的中药材提取方面具有重大的应用意义[23-24]。

2.7 半仿生提取法

半仿生提取法(简称SBE法)，主用用于中药制剂。半仿生法是将药料使用酸水和碱水顺序提取，继而将提取液分别过滤、浓缩，制成制剂，利用模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理，为经消化道给药的中药试剂提供的一种提取工艺。以杜仲叶为原料，以磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲溶液作为提取液，通过正交试验优化半仿生法提取黄酮工艺，当杜仲叶∶提取液=1∶20时，最终黄酮的得率为0.044%[25]。半仿生提取法的特点：①提取过程符合中医配伍、临床用药特点、口服药物在胃肠道的转运特点；②最大限度地保留有效成分，并且活性成分损失较少；③不仅能使混合物充分发挥其综合作用，又能利用单体成分控制质量。因此，该方法在中药的有效成分提取和配方研究中有良好优势和广泛的应用前景[26]。

3 杜仲中黄酮类化合物的分离纯化

3.1 薄层层析色谱法

马柏林等[27]以十二烷基硫酸钠-正丁醇-正庚烷-水微乳液作为展开剂，通过聚酰胺薄层色谱对杜仲叶黄酮进行简单分离，效果良好。

3.2 大孔吸附树脂

大孔吸附树脂是一类不含交换基团的有机高分子聚合物，是柱色谱常用的一种吸附剂，因其处理量大、分离效果好而被广泛应用于黄酮类物质的分离纯化。付桂明等[28]通过大孔树脂对杜仲叶黄酮物质进行富集纯化，发现AB-8树脂的吸附率和解吸率最高，黄酮质量分数从10.2%升到42.6%。潘莹[29]筛选D101-1大孔树脂吸附纯化杜仲黄酮，分离纯化效果显著，使纯度升为54.43%。张玲等[30]对杜仲叶黄酮类化合物进行分离纯化，从9种树脂中筛选纯NKA-Ⅱ，分离效果良好，最终得到4种组分，分别为绿原酸、金丝桃苷或陆地锦苷、槲皮素-乙酰糖苷和槲皮素。

4 杜仲中黄酮类化合物的生物活性

黄酮类化合物广泛分布在植物中，因其结构的多样性以及不同的类型，所表现出生物活性和功能也不相同，具体如下。

4.1 抗氧化活性

黄酮类化合物属于多酚类物质，抗氧化活性强，基本无毒副作用。黄酮类化合物的抗氧化机制主要表现在以下两方面：①链的中断机制，黄烷和原花青素等黄酮类化合物在脂质过氧化反应中能切断自由基链，以达到抗氧化的目的。②促使产生自由基的催化剂失活，对体内酶的作用，黄酮类化合物分子中富含酚羟基，与酶蛋白分子结合，抑制相关酶的活性。对金属离子的作用，黄酮类化合物分子结构中的羰基或相邻的羟基可以与金属离子形成五元或六元的配合物，从而清除引发活性自由基产生链反应的催化剂。罗飞华等[31]对杜仲叶黄酮提取物进行抗氧化活性分析，发现黄酮类化合物具有较强的还原能力，具有显著的超氧阴离子清除能力。

4.2 抗疲劳活性

杨津等[32]通过动物实验研究杜仲叶中黄酮类化合物对小鼠抗疲劳作用的影响，通过观察对照组和黄酮苷给药组，发现黄酮苷给药组负重游泳时间延长，小鼠血清中超氧化物歧化酶含量升高，说明杜仲叶黄酮苷具有显著的抗疲劳作用。

4.3 降血糖活性

沈伊濛等[33]通过正交试验研究杜仲叶黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性的影响，并对杜仲叶黄酮含量进行分析测定，含量达18.12%。邢冬杰等[34]探讨杜仲叶黄酮对高血糖火鼠血糖的控制，建立糖尿病大鼠模型，设定实验组和对照组，每日给药连续28 d，结果发现杜仲叶黄酮能明显降低糖尿病大鼠中胰腺组织的丙二醛水平，升高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平。

4.4 降血脂活性

杜仲叶黄酮的降血脂作用，通过建立动物模型，并进行分组给药按照大中小三种剂量的黄酮水平分别对实验组灌胃操作，结果发现给药组的血浆总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇含量等显著降低，高密度脂蛋白胆固醇、过氧化氢酶等有所上升，证明黄酮对降血脂具有显著效果。雷燕妮等[35]探索杜仲叶黄酮降血脂作用，通过建立高血脂动物模型，分析对照组和高血脂模型组的结果，发现杜仲叶总黄酮能显著降低高血脂小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的含量，高密度脂蛋白胆固醇的含量有升高趋势，说明其具有显著的降血脂作用。

4.5 降血压活性

雷燕妮等[36]采用微波辅助法提取杜仲叶黄酮类化合物，并建立高血压小鼠动物模型，通过对照组和给药组结果比较，发现黄酮类化合物能显著降低给药组的血压水平。目前杜仲中已知的降血压成分为脂素类、苯丙素类、环烯醚萜类和黄酮类[37]。

5 展望

杜仲是我国独有的经济物种，资源丰富，杜仲的产业化应用主要在生态园林绿化、医疗保健和食品开发、橡胶的应用等，杜仲在食品领域的应用主要是功能食品开发。杜仲皮、杜仲胶目前已经达到了很高的产业化推广应用，但是资源丰富的杜仲叶并未被全面开发应用，长期以来，杜仲叶被用于动物饲料，造成资源极度浪费[38]。杜仲叶化学成分复杂，很多被研究证明具有药理活性，如抗氧化、抗疲劳、降血压、降血脂等[39]。但是其在临床试验中使用范围较窄，导致杜仲中成药品种较少。目前很多的活性功能机理研究还不够透彻，本文以杜仲叶中黄酮类化合物为例，对其提取工艺、分离纯化方法、功能活性等进行汇总。研究证明杜仲叶黄酮类化合物具有很多功能活性，但是目前机理尚不明晰，需要进一步的研究充分证明。笔者认为，杜仲叶的应用方向主要为：①将杜仲叶的活性成分进行分离纯化鉴定，如杜仲叶黄酮类化合物的纯化鉴定及功能活性分析；②开发出更多的杜仲叶功能性食品，如杜仲茶、杜仲饮料、杜仲酒等。21世纪大健康食品和营养食品发展空间巨大，目前人们对纯天然的植物产品备受青睐，这给杜仲叶产品的开发带来很大的机遇和挑战，对大健康产业也具有很大的助推作用。