钝顶螺旋藻多糖的提取工艺及其生物活性

张亚旗，卢珍华，黄世英，李桂玲，2，李 健，2

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省海洋功能食品工程技术研究中心，福建 厦门 361021)

0 引言

螺旋藻是蓝藻纲颤藻科的一类低等生物，由单细胞或多细胞组成的丝状体，体长200～500 μm，宽5～10 μm，圆柱形，呈疏松或紧密的有规则的螺旋形弯曲，形如钟表发条，故而得名[1-2]。螺旋藻主要分为钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)和极大螺旋藻(Spirulinamaxima)，其中钝顶螺旋藻富含蛋白质、多糖、叶绿素、β-胡萝卜素、γ-亚麻酸、维生素、微量元素、藻蓝蛋白等[3-5]。螺旋藻营养均衡，具有脂肪和胆固醇含量低、蛋白质含量高的特点，在人类保健食品领域逐渐扮演重要的角色。联合国粮农组织和世界卫生组织认为螺旋藻是21世纪人类最佳食物和最佳营养品[6-7]。

植物多糖是一种重要的天然活性成分，广泛存在于自然界的植物体中，是由许多α-糖苷键或β-糖苷键连接所形成的化合物[8]。其中钝顶螺旋藻多糖具有多种特殊的生理作用，能够有效起到抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-I)活性的作用[9]、对角膜新生血管的抑制作用[10]，对免疫刺激活性增加[11]、降血脂[12]、调节肠道微生物[13]以及肝素辅助因子Ⅱ介导的抗凝活性等有重要作用[14]。钝顶螺旋藻多糖提取的常用方法有热水浸提法、碱液浸提法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、反复冻融破壁提取法和酶辅助提取法等[15-19]。Chaiklahan等[20]运用热水浸提法提取螺旋藻多糖，通过响应面优化最终多糖得率为8.3%。由于钝顶螺旋藻中蛋白质含量高达60%～70%，蛋白质脱除就成了钝顶螺旋藻多糖制备过程中一个非常关键的环节。目前常用的除蛋白质方法主要有蛋白酶水解法、Sevag法、三氯乙酸法、加热浓缩法等[21]。其中Sevag法是去除蛋白质的经典方法，它具有操作简便、试剂廉价、去除游离蛋白质效果好等优点[22]。由于Sevag法使用有毒有害试剂，扩大生产易造成环境污染，从工业化生产的角度考虑，需要探究一种更加环保和低成本的生产工艺。

本文采用热碱浸提法提取钝顶螺旋藻粗多糖，等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺进行脱蛋白，并与Sevag法脱蛋白进行对比，研究了不同浓度下钝顶螺旋藻多糖的DPPH自由基的清除能力及其对正常细胞LO2、肿瘤细胞HepG2增殖的抑制作用。通过单因素实验和正交设计试验优化钝顶螺旋藻多糖的最佳提取工艺，为钝顶螺旋藻多糖的提取和工业化生产提供科学依据，同时也为钝顶螺旋藻多糖的生物活性研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

钝顶螺旋藻干粉，购于福建神六保健品有限公司。

苯酚、浓硫酸、葡萄糖、NaOH、乙醇(体积分数95%)、盐酸、正丁醇、二甲基亚砜(DMSO)、氯仿、二水柠檬酸钠、柠檬酸、十二水磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；1 mL Uni SP/CM/Q/DEAE 50xs(预装柱)，苏州纳微科技有限公司；硅藻土(DP20)，青岛盛泰硅业有限公司；碧云天蛋白质测定试剂盒；四甲基噻唑蓝(MTT)，南京奥多福尼生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-8000A型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司;C-MAG HS 10数显型加热磁力搅拌器，德国IKA集团；GE AKTA Pure蛋白纯化仪，GE Healthcare，瑞典；冰箱，青岛海尔股份有限公司；PH211酸度计，HANNA instruments；超滤平板膜小试设备，福建福美科技有限公司；布氏漏斗，化通天下实验仪器耗材；抽滤瓶，化通天下实验仪器耗材；5810R高速冷冻离心机，德国艾本德股份有限公司；Synergy H1MF多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验流程

等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺：螺旋藻藻悬液经过热碱浸提，在pH=4条件下进行等电点沉淀，用质量分数10%硅藻土抽滤，收集滤液进行阳离子交换和色谱层析，得到螺旋藻多糖。

Sevag法脱蛋白：螺旋藻藻悬液经过热碱浸提，10 000 r/min下离心10 min，取上清液进行乙醇沉淀、静置，再10 000 r/min下离心10 min，收集沉淀进行Sevag法脱蛋白，得到螺旋藻多糖。

1.3.2 热碱浸提螺旋藻多糖单因素试验

研究料液比、浸提温度、浸提时间及碱液质量分数对多糖提取率的影响。称取2.00 g样品5份，分别溶解于不同量的蒸馏水中，使料液比(m∶V)分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50；浸提温度分别取50，60，70，80，90 ℃；浸提时间1～5 h；NaOH质量分数为0.5%，0.75%，1.0%，1.25%，1.5%，进行水浴浸提。冷却至常温，10 000 r/min离心10 min收集上清液，采用1∶1盐酸溶液调节上清液pH=7，测定多糖含量，并计算多糖得率。初步确定各单因素的最佳水平范围。每个处理做3次平行实验。

1.3.3 螺旋藻多糖提取工艺优化

在单因素试验的基础上，设计正交试验的因素与水平表，如表1所示。

表1 正交试验因素与水平表

1.3.4 脱蛋白方法

脱蛋白方法采用等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺法和Sevag法。

等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺法：在螺旋藻碱提液中加入6 mol/L的盐酸溶液，调节碱提液pH=4，加入质量分数10%的硅藻土，搅拌均匀，使用布氏漏斗进行抽滤，将滤液脱盐。将脱盐后的滤液使用离子交换色谱进行脱蛋白，阳离子交换色谱柱使用10 mmol/L pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液进行洗脱，阴离子交换色谱柱使用20 mmol/L pH=7.8的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，分别收集透过液，测定多糖及蛋白质浓度。

Sevag法：氯仿与正丁醇混合体积比为5∶1，配制成Sevag试剂。样品溶液与Sevag试剂体积比为4∶1，然后用电动搅拌器以200 r/min的速度搅拌5 min，于分液漏斗中静置30 min。弃去下层液，并移取一定量上层液测定其蛋白质和多糖浓度，重复上述操作。

1.3.5 螺旋藻多糖对DPPH自由基的清除能力

用DPPH法测定螺旋藻的抗氧化活性[23-24]。准确称取DPPH 4 mg溶解于体积分数50%乙醇溶液中，配制成0.1 mmol/L的DPPH工作液。将不同浓度的多糖样品溶液100 μL分别加入100 μL的DPPH工作液，混合均匀后避光反应30 min，VC作为对照，在517 nm处测定吸光度值(A1)，其中空白对照以体积分数50%乙醇代替样品，测定其吸光度值(A0)；样品对照以体积分数50%乙醇代替DPPH溶液，测定其吸光度值(A2)。DPPH自由基清除率计算公式如下：清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.3.6 细胞毒性实验

通过MTT法测定LO2和HepG2细胞的活力[25]。将处于对数生长期的细胞以每孔100 μL(1×104个)接种于96孔细胞培养板中，置于体积分数5% CO2、37 ℃ CO2细胞恒温培养箱中孵育12 h后，吸弃上清液，加入含有不同浓度多糖样品的DMEM高糖培养基，处理24 h，吸弃上清液，加入含15 μL 5 g/L MTT溶液的DMEM高糖培养基115 μL，培养4 h。待培养结束后，加入150 μL DMSO，振板10 min，在490 nm下测定其吸光度值。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖标准曲线

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。称取0.1 g 105 ℃下干燥恒重的葡萄糖定容至100 mL容量瓶中，得到标准葡萄糖溶液(1 g/L)，摇匀备用。将配制好的标准葡萄糖溶液分别稀释配制成0，20，40，60，80，100 mg/L 的溶液,精确移取以上不同浓度的葡萄糖溶液1.0 mL,加入1 mL质量分数6%苯酚溶液,再加入5 mL的浓硫酸,混匀，静置30 min后在490 nm 处测定其吸光度值,以吸光度值为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：y=0.009 47x-0.007 47，R2=0.999 7。

1.4.2 多糖含量的测定

将螺旋藻多糖溶液适当稀释后，从中吸取1 mL，加入1 mL质量分数6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸，混匀，静置30 min。在490 nm处测定吸光度值，代入标准曲线方程得到对应的葡萄糖浓度，按下列公式计算样品中多糖得率：多糖得率/%=(c×V×n×100)/m，式中：c为样品溶液中葡萄糖质量浓度(mg/L)；n为样品溶液稀释倍数；V为测定溶液体积(mL)；m为螺旋藻藻粉质量(g)。

1.4.3 螺旋藻多糖脱蛋白率和多糖损失率的测定

采用碧云天蛋白质测定试剂盒测定蛋白质含量，并以此计算不同脱蛋白方法对多糖溶液蛋白质脱除率的影响。

蛋白质脱除率公式如下：蛋白质脱除率/%=(N1-N2)×100/N1，式中：N1为去除蛋白质前原液中蛋白质的含量；N2为去除蛋白质后原液中蛋白质的含量。

多糖保留率的计算公式为：多糖保留率/%=(M2/M1)×100，式中，M1为去除蛋白质前原液中多糖的含量；M2为去除蛋白质后原液中多糖的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

不同温度条件下螺旋藻多糖浸出效果见图1a。可以看出，在50～90 ℃温度范围内，50～80 ℃，螺旋藻多糖得率随温度的升高而不断增大，且增幅明显，当温度升高至90 ℃时，多糖得率增大幅度明显减小。温度升高，能够增加反应速率，使分子运动加快，有利于多糖从细胞中溶出，并且增加了多糖在水中的溶解度[26]。

碱质量分数对螺旋藻多糖浸出效果的影响见图1b。可以看出，在碱性环境下，碱质量分数对多糖浸提的有利因素主要体现细胞壁被分解破坏，有利于胞内多糖及细胞壁中的多糖溶出[27]。由图1b可以看出，粗多糖得率随NaOH浓度升高而呈增加趋势。而碱质量分数过高对多糖的浸提也会产生一些不利的影响，易使蛋白质变性产生絮状沉淀，包裹部分多糖，造成多糖的损失[28]。由图1b可见，当NaOH质量分数为1.25%时，多糖得率达到最大值，之后多糖得率开始下降，说明过高的碱质量分数确实不利于多糖的浸提。

提取时间对螺旋藻多糖浸出效果的影响见图1c。可以看出，多糖得率随着提取时间的增加而增大，这说明反应时间过短时，碱法提取不充分，因而得率随着时间的延长而提高，提取时间越长多糖得率越高[29]。在提取时间为3 h时，粗多糖得率变化最小，曲线趋于平稳，甚至稍稍出现下降的情况，表明反应已经基本达到平衡状态。随着反应时间的增加，蛋白质变性和多糖水解也在不断进行，不利于多糖的提取。

料液比对螺旋藻多糖浸出效果的影响见图1d。可以看出，不同的料液比会显著影响螺旋藻多糖的得率[30]。当料液比超过1∶20时，随着溶剂用量的增加，多糖得率增长幅度减缓，表明此时螺旋藻已基本浸提完全。从整个提取工艺来看，增加提取剂的用量可降低浸出液体系中蛋白质及多糖的浓度，有利于减少后续过滤过程中因浸出液流失及脱除蛋白过程中蛋白质沉淀对多糖的吸附造成的多糖损失[31]。但是用水量过多，会导致后续工艺的能耗负担及用水成本的增加。

2.2 提取工艺正交试验结果

由表2可知，对螺旋藻多糖提取影响因素大小分别为：提取温度>碱质量分数>料液比>浸提时间。得到最佳组合为 A2B2C2D2，即：提取时间为3 h，料液比(m∶V)为1∶20，提取温度为80 ℃，碱质量分数为1.25%。在此条件下进行3次验证实验，多糖提取率达到8.78%。

表2 正交试验设计及结果

由表3可知，校正模型具有显著性，其中A、B因素对提取率无显著影响，表明提取时间和料液比2个因素对螺旋藻多糖的提取基本无影响，提取温度、碱质量分数2个因素对螺旋藻多糖的提取影响极显著(P<0.01)。因此，提取温度和碱质量分数2个影响因素可作为提取过程中影响多糖提取率的首要考虑因素，且该提取方法可用于螺旋藻多糖的提取。

表3 正交试验的方差分析

李会端等[32]采用单因素试验分析螺旋藻多糖的碱提取最佳条件，发现碱提取工艺条件为：NaOH浓度为0.4 mol/L，料液比为1∶25(g∶mL)，提取时间为2 h，多糖提取率为4.524%。郝志欣等[33]采用单因素试验和正交试验对热碱浸提法提取螺旋藻多糖工艺进行优化，得到最佳提取工艺为：pH=11，温度为80 ℃，固液比为1∶30，浸提2次，浸提时间为1 h，多糖得率为4.213 %。这些研究报道与本研究相比，多糖得率均低于本研究的。

2.3 螺旋藻多糖脱蛋白研究

2.3.1 等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺法脱蛋白

由图2a可知，随着螺旋藻多糖溶液pH值的上升，蛋白质的脱除率不断下降，多糖的保留率升高，说明螺旋藻粗多糖溶液中的杂蛋白的等电点主要在2～4。在pH=2时，蛋白质脱除率达到最高，但此时的多糖保留率低。推测可能是由两个原因造成：其一，由于酸性环境中部分多糖被水解，多糖损失过多；其二，由于蛋白质沉降时包裹了部分多糖一并沉降下来，导致多糖损失过多。因此，根据图2a，选择pH=4进行等电点沉淀最为合适，和陈昕等[34]研究结果一致，此时多糖保留率为90.75%，蛋白质脱除率为48.24%。将经等电点沉淀后的粗多糖溶液使用不同的色谱柱进行脱蛋白处理。

由图2b可知，4种色谱柱对多糖的吸附能力为Q>DEAE>CM>SP，对蛋白质的吸附能力为SP>CM>DEAE>Q。推测，经过等电点沉淀后，溶液中的大部分蛋白质带正电荷，流经树脂时，带正电荷的蛋白质和其他杂质被交换到树脂上，大部分螺旋藻多糖由于分子质量较大，所带电荷较弱无法交换到树脂内部，当粗多糖流过树脂时，多糖因不带电较快流出，大部分蛋白质被吸附在色谱柱上，只有少部分流出。阴离子交换树脂对螺旋藻多糖有部分吸附，可能是因为螺旋藻多糖中带有硫酸根离子的多糖被阴离子交换树脂吸附[34]。综合考虑，选择强阳离子色谱柱层析作为进一步纯化螺旋藻多糖的方式。通过等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺法脱蛋白得到多糖的保留率为86.62%，蛋白质脱除率为89.54%。经实验验证，等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺法脱蛋白最终多糖得率为7.55%。

2.3.2 Sevag法脱蛋白

由于螺旋藻中蛋白质含量较高，Sevag法脱蛋白过程中需要反复处理。由图3可以看出，随着脱蛋白次数的增加，蛋白质脱除率越来越高，但是多糖保留率越来越低。Sevag法主要对游离蛋白质脱除效果较为明显，但对于多糖结合很牢固或被多糖包裹的蛋白质的效果较差。所以可能是因为少量的蛋白质与多糖结合紧密，以糖蛋白的形式存在不易被去除。在反复处理的过程中，每次去除蛋白质变性的胶状物时，不可避免溶有多糖，与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白也会在处理时会沉淀下来，造成多糖损失[35]。因此，一般脱蛋白次数不宜过多。由图3可以看出，脱蛋白次数为3次最为合理，此时蛋白质脱除率为48.40%，多糖保留率为72.03%。经实验验证，Sevag法脱蛋白最终的多糖得率为6.33%。

2.4 螺旋藻多糖对DPPH的清除能力

在DPPH测定中，抗氧化剂是单电子与DPPH自由基配对，使其在517 nm处的强吸收逐渐消失，其褪色程度与接受的电子数量相关[36]。使用DPPH法测定螺旋藻多糖在0.4～2.0 g/L质量浓度下的抗氧化能力，结果如图4所示。可见，螺旋藻多糖具有一定的抗氧化能力，并且螺旋藻多糖的DPPH自由基清除能力与浓度呈正相关，随着浓度的不断提高，DPPH自由基清除能力从27.68%提升至59.09%。丁小梅等[37]在pH=8、温度为90 ℃、料液比为1∶40、提取时间为2 h的条件下提取出的螺旋藻多糖具有DPPH自由基清除能力，其IC50为0.463 g/L。周志刚等[38]采用热水浸提提取螺旋藻多糖，发现其无显著的抗氧化能力。可见，不同提取方法和提取条件所得到的螺旋藻多糖，其抗氧化能力与作用也不同。因此，可推测螺旋藻多糖的抗氧化能力与多糖结构相关，需进一步研究。

2.5 螺旋藻多糖细胞毒性实验测定结果

MTT是一种可以被活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶还原的染料物质，可以形成水不溶性蓝紫色结晶甲臜而沉淀在细胞中，死细胞无法将其还原。二甲基亚砜(DMSO)可以溶解细胞中的蓝紫色甲臜，利用酶标仪在490 nm处测定其吸光度值，可以间接反映活细胞数量。在一定细胞数内，MTT结晶甲臜形成的量与活细胞数成正比，从而反映活细胞的增殖情况[39]。通过MTT法分别检测了螺旋藻多糖对正常的肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2增殖能力的影响，结果如图5所示。图5a为螺旋藻多糖对正常的肝细胞LO2增殖能力的影响，可见，在100～2 000 mg/L范围内螺旋藻多糖对LO2细胞的增殖能力无明显影响。图5b为螺旋藻多糖对肝癌细胞HepG2增殖能力的影响，可见，螺旋藻多糖在10～100 mg/L 范围内对HepG2细胞增殖能力无影响，但随着浓度的不断升高，500,1 000和2 000 mg/L 的螺旋藻多糖对HepG2细胞有明显的毒性作用，细胞存活率分别下降至78.97%，74.96%和73.08%，细胞增殖能力显著下降(P<0.05),具有统计学意义。朱劲华等[40]研究了螺旋藻多糖对回肠癌HCT-8、神经胶质瘤U251、宫颈癌HeLa、肝癌SMMC7721和肺癌A549细胞增殖能力的影响，同时与人的正常肝细胞LO2进行比较，发现螺旋藻多糖对癌症细胞增殖能力有显著的抑制作用，但对正常肝细胞LO2的增殖能力影响较弱，并且存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强，与本研究结论一致。

3 结论

本研究通过单因素及正交试验，优化了热碱浸提法提取螺旋藻粗多糖。设计了一种等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用脱蛋白的新工艺，并与Sevag法脱蛋白作了对比。结果表明，热碱浸提的最佳工艺条件：料液比(m∶V)为1∶20，浸提温度为80 ℃，浸提时间为3 h，碱质量分数为1.25%，在此条件下，使用等电点沉淀与离子交换树脂分离技术联用工艺法脱蛋白多糖总提取率达到7.55%，蛋白质脱除率达到89.54%。相对于Sevag法脱蛋白，多糖得率提高了17.3%，蛋白质脱除率提高了45%。此条件下获得的螺旋藻多糖具有一定的抗氧化能力，并且对正常细胞LO2无毒性，对肝癌细胞HepG2具有一定的抑制增殖作用。今后拟对螺旋藻多糖进一步分离纯化，并对其结构进行鉴定与解析，通过小鼠实验对抗癌作用进行深入探讨。